引用本文： 舒克鋼, 陳秀娟, 雷焦, 陳茂劍, 聶浩, 張燕翔, 王超, 龔權. 橙皮苷通過抑制高遷移率族蛋白B1釋放減輕對乙酰氨基酚致小鼠急性肝損傷. 華西醫學, 2014, 29(5): 858-862. doi: 10.7507/1002-0179.20140262 復制
橙皮苷（HDN）為橙皮素與蕓香糖形成的二氫黃酮苷類化合物，是柑橘類藥用植物果實的主要藥效成分或代謝成分[1]。大量研究顯示，HDN具有抗氧化、清除氧自由基作用[2, 3]，調節心血管功能[4]，抗腫瘤[5]，抗輻射損傷[6]，對神經系統的保護作用[7]等多種藥理活性。高遷移率族蛋白B1（HMGB1）是一種核內蛋白，因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）中遷移迅速而得名[8]。近年發現，HMGB1可由壞死細胞被動釋放或由活化的免疫細胞主動分泌，釋放至細胞外的HMGB1可與白細胞介素（IL）-1、IL-6和腫瘤壞死因子-α等多種炎癥因子相互誘生，參與多種免疫病理過程[9, 10]。因此，以HMGB1為靶點治療相關疾病可能具有重要臨床價值。對乙酰氨基酚（APAP）在1955年被美國食品和藥物管理局批準作為兒童常用的解熱鎮痛藥，但大劑量的使用會導致一定的肝毒性和腎毒性[11]。本研究探討了HDN對APAP所致小鼠急性肝損傷的保護作用，并探討其機制。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
HDN、APAP均購自美國Sigma公司；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）購自天津市科密歐化學試劑有限公司；聯苯雙酯滴丸購自浙江萬邦藥業股份有限公司；丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）試劑盒、考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒均購自南京建成生物工程有限公司；總RNA提取試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司；逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）試劑盒購于寶生物工程（大連）有限公司；PCR引物由上海生工生物工程技術服務公司合成；兔抗鼠HMGB1多克隆抗體本室保存[12]；辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG購自上海碧云天生物技術有限公司。
1.2 動物
清潔級BALB/c小鼠，雄性，體質量18～22 g，武漢大學動物實驗中心提供，合格證號：SCXK（鄂）2008-0004。
1.3 方法
1.3.1 動物模型建立
48只雄性BALB/c小鼠隨機均勻分為6組，每組8只，分別為正常組、模型組、HDN組（劑量分別為500、250、125 mg/kg）、聯苯雙酯組（150 mg/kg）。HDN組分別灌胃不同濃度的HDN懸濁液，聯苯雙酯組灌胃等量聯苯雙酯溶液，正常組和模型組灌胃同體積的CMC-Na溶液，1次/d，連續10 d。末次給藥后禁食不禁水，2 h后除正常組外其余各組均腹腔注射APAP溶液150 mg/kg造模，正常組注射同體積的CMC-Na溶液。16 h后，眼球取血，處死小鼠。
1.3.2 相關指標的檢測
取血0.5～1.0 mL，室溫靜置30 min，4℃離心3 000 r/min×15 min，取上清液，運用自動生化分析儀檢測血清谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）。取一定量的肝左葉組織，加9倍重量冷生理鹽水制成10%肝勻漿，所有操作均在冰浴中進行。嚴格按照試劑盒說明書測定GSH活性和MDA含量。
1.3.3 肝臟病理學觀察及分級
取肝右葉用10%中性甲醛溶液固定，常規石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，光學顯微鏡下觀察肝臟病理組織學改變并分級。肝臟病理分級如下：0級：未見明顯病理損傷；1級：肝組織濁腫伴有散在的點狀壞死，匯管區少許炎性細胞浸潤；2級：肝細胞濁腫有點狀壞死及小灶性壞死，可見散在的肉芽腫形成，匯管區有大量炎性細胞浸潤；3級：肝細胞濁腫并伴有片狀壞死，肉芽腫形成，匯管區及周圍有大量炎性細胞浸潤。
1.3.4 免疫組織化學法檢測HMGB1的表達
石蠟切片常規二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，3% H2O2室溫孵育5～10 min，微波抗原修復，磷酸鹽緩沖液（PBS）浸泡5 min×1次，二抗正常血清封閉30 min，一抗孵育4℃過夜，PBS沖洗5 min×3次，羊抗鼠IgG孵育37℃30 min，鼠PAP孵育37℃ 30 min，PBS沖洗5 min×3次，二氨基聯苯胺顯色，蘇木精復染，自來水充分沖洗、脫水、透明、封片。顯微鏡觀察免疫組織化學肝組織切片。
1.3.5 RT-PCR法測定肝組織HMGB1
mRNA 用總RNA試劑盒提取總RNA，紫外分光光度計測定A260/A280比值，判斷其濃度和純度。嚴格按照RT-PCR試劑盒說明書逆轉錄為cDNA后進行擴增，-80℃保存。HMGB1上游引物：5’-GATGGGCAAAGGAGATCCTAAG-3’，下游引物：5’-TCACTTTTTTGTCTCCCCTTTGGG-3’；β-actin上游引物：5’-TGGAATCCTGTGGCATCCAT-3’，下游引物：5’-ACGCAGCTCAGTAA-3’。0.5 mL的PCR反應管中依次加入下列反應液：雙蒸水13.3 μL，10×Buffer 2.0 μL，脫氧核糖核苷三磷酸1.5 μL，HMGB1或β-actin引物各0.6 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，cDNA 1.5 μL，總體積20 μL，短暫離心后進行PCR。PCR擴增條件為HMGB1：94℃預變性5 min，94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，共30個循環，最后72℃延伸5 min，10℃保存；β-actin：94℃預變性5 min，94℃變性 30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個循環，最后72℃延伸7 min，10℃保存。取PCR產物7 μL在2%的瓊脂糖凝膠上樣電泳，用BIO-Rad凝膠成像系統分析電泳帶，β-actin作為內參照，以HMGB1/β-actin的比值作為HMGB1 mRNA相對表達量。
1.4 統計學方法
采用SPSS 17.0統計學軟件處理，實驗數據均以均數 ± 標準差表示，組間比較采用t檢驗，半定量資料采用Ridit分析。P值＜0.05為有統計學意義。
2 結果
2.1 HDN對小鼠血清ALT、AST水平的影響
模型組ALT、AST水平較正常組有顯著的升高（P＜0.01）；其他各實驗組血清ALT、AST水平較模型組均顯著降低（P＜0.01）。見表 1。
表1
各組小鼠血清ALT和AST（n=8，2.2 HDN對小鼠肝勻漿MDA、GSH的影響
與正常組相比，模型組肝勻漿GSH活力顯著降低，MDA含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，HDN 500 mg/kg濃度組、250 mg/kg濃度組和聯苯雙酯組GSH活力顯著升高（P＜0.01），MDA含量顯著降低（P＜0.01），以HDN 500 mg/kg濃度組和聯苯雙酯組效果最為顯著。HDN 100 mg/kg濃度組無明顯變化，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 2。
表2
各組小鼠肝勻漿MDA、GSH水平（n=8，2.3 HDN對小鼠肝臟病理變化的影響
光學顯微鏡下正常組小鼠肝組織結構清晰，肝細胞索圍繞中央靜脈呈放射狀整齊排列，未見明顯病理變化；模型組肝組織可見明顯以中央靜脈為中心的彌漫性大片壞死，肝細胞、肝索結構均消失，并伴有大量炎性細胞浸潤；聯苯雙酯組和HDN組肝細胞變性、壞死、炎性細胞浸潤程度較模型組均明顯減輕，其中聯苯雙酯組和HDN 500 mg/kg濃度組肝小葉結構基本正常，肝索排列較整齊，肝細胞水腫不明顯，炎性細胞浸潤較少，接近正常肝組織。各組病理分級Radit平均值＜0.500，病理變化較輕。見表 3、圖 1。
圖1
各組小鼠肝組織病理變化（HE×400） 1a.正常組結構清晰，未見明顯異常 1b.模型組肝組織可見明顯以中央靜脈為中心的彌漫性大片壞死，伴有大量炎性細胞浸潤 1c～1f. 其他各組肝組織較模型組損傷程度明顯減輕1c. HDN 500 mg/kg 濃度組 1d. HDN 250 mg/kg 濃度組 1e. HDN 125 mg/kg 濃度組 1f. 聯苯雙酯組 ? ?圖 2 各組小鼠肝臟HMGB1表達（免疫組織化學染色×400） 2a.正常組未見陽性細胞 2b.模型組HMGB1陽性細胞（白箭）明顯增多 2c. HDN 500 mg/kg濃度組陽性細胞（白箭）少見
表3
各組小鼠肝臟病理分級（n=8，2.4 免疫組織化學法分析HMGB1表達
HMGB1在正常肝組織中大多數表達在細胞核，在細胞質中不表達或少量表達。與正常組相比，模型組肝組織中HMGB1陽性細胞數明顯增多；與模型組相比，HDN高濃度組HMGB1陽性細胞數顯著減少。見圖 2。
2.5 RT-PCR測定肝勻漿HMGB1 mRNA轉錄水平
與正常組相比，模型組肝組織HMGB1 mRNA水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比，HDN各組和聯苯雙酯組可不同程度的降低HMGB1 mRNA水平，差異具有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05）。見圖 3。
圖3
各組小鼠肝組織HMGB1 mRNA轉錄水平 *與正常組比較， P＜0.01；#與模型組比較，P＜0.01。其中1為正常組，2為模型組， 3為HDN 500 mg/kg 濃度組，4為HDN 250 mg/kg 濃度組，5為HDN 125 mg/kg濃度組，6為聯苯雙酯組 3a. 電泳圖 3b. 條形統計圖
3 討論
APAP主要通過肝臟細胞色素P450代謝生成親電子產物乙酰苯醌亞胺（NAPQI），其可與細胞內多種生物活性大分子結合，并導致細胞內鈣升高和脂質過氧化反應，從而損傷肝細胞 [2]。大量研究證實，HDN對APAP所致的急性肝、腎損傷均有一定的保護作用[11]。本研究通過建立對APAP急性肝損傷動物模型，進一步探討HDN對APAP所致急性肝損傷的保護作用及相關機制。
本研究中，模型組血清ALT、AST明顯升高，病理切片顯示以中央靜脈為中心的彌漫性大片壞死，表明本研究成功建立急性肝損傷動物模型。肝臟脂質過氧化的程度可以通過脂質過氧化物等指標來評價。MDA是脂質過氧化的終產物，可嚴重破壞細胞膜結構，導致細胞腫脹、壞死，因此其組織含量的多少，可以間接反映肝細胞的損傷程度。GSH對于協調機體抗氧化過程起關鍵作用，與還原型GSH構成了抗氧化的第一道防線[13]。因此，測定肝勻漿GSH能夠直觀反映肝臟受損情況，其活力大小反映機體抗氧化和清除自由基的能力。本研究結果顯示，HDN能顯著降低血清ALT、AST水平和MDA含量，升高肝勻漿GSH活力，表明HDN對肝損傷保護作用機制可能與其抗氧化和清除自由基有關。HDN可能通過提高GSH活性，增強機體抗氧化和清除自由基的能力，降低肝細胞的脂質過氧化反應，從而對肝細胞產生保護作用。
HMGB1是一類在真核細胞中含量豐富的非組蛋白核蛋白，即核DNA結合蛋白，其在維持核小體結構，調控DNA的復制、轉錄、重組和修復中具有重要作用[14, 15]。HMGB1通過兩種機制釋放到細胞外，一種是通過受損組織中損傷或壞死細胞被動釋放，作為危險信號誘導其他細胞發生非生理性死亡；另一種是包括巨噬細胞和中性粒細胞在內的炎癥細胞主動分泌，其首先經乙酰化并由核內轉移至溶酶體內，繼而在三磷酸腺苷和溶血磷脂膽堿兩種分泌信號作用下轉移至細胞外[16, 17]。研究表明，HMGB1釋放到細胞外后，可作為炎癥介質，與多種炎癥介質相互誘生，參與多種病理生理過程，維持和放大炎癥效應[10]。在缺血-再灌注誘發肝損傷的實驗小鼠模型中，缺血-再灌注1 h后肝臟HMGB1蛋白表達增加，提示HMGB1參與了炎癥和器官損害的病理過程；給再灌注動物注射重組HMGB1則顯著增加血清肝酶譜水平并使肝損傷進一步惡化；而使用多克隆抗體阻斷HMGB1可保護小鼠免受肝缺血-再灌注損傷[18]。在Con A所致的急性肝損傷中，肝組織HMGB1 mRNA水平明顯增高，而外源性的HMGB1抗體可有效降低實驗小鼠的肝損傷[19]。這些研究結果均提示HMGB1參與促炎癥和器官損傷的病理過程。本研究發現，模型組小鼠肝組織HMGB1 mRNA水平明顯升高（P＜0.01），HDN組HMGB1 mRNA水平明顯降低（P＜0.01或0.05），HDN 500 mg/kg濃度組HMGB1陽性顆粒細胞數較模型組顯著減少，表明HDN減輕APAP所致急性肝損傷可能與其抑制HMGB1 mRNA轉錄和蛋白表達有關，但具體機制尚需進一步深入研究。
總之，HDN對APAP誘導小鼠急性肝損傷具有保護作用，可能與其抑制HMGB1 mRNA轉錄和釋放有關，具體機制尚需進一步深入研究。
橙皮苷（HDN）為橙皮素與蕓香糖形成的二氫黃酮苷類化合物，是柑橘類藥用植物果實的主要藥效成分或代謝成分[1]。大量研究顯示，HDN具有抗氧化、清除氧自由基作用[2, 3]，調節心血管功能[4]，抗腫瘤[5]，抗輻射損傷[6]，對神經系統的保護作用[7]等多種藥理活性。高遷移率族蛋白B1（HMGB1）是一種核內蛋白，因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）中遷移迅速而得名[8]。近年發現，HMGB1可由壞死細胞被動釋放或由活化的免疫細胞主動分泌，釋放至細胞外的HMGB1可與白細胞介素（IL）-1、IL-6和腫瘤壞死因子-α等多種炎癥因子相互誘生，參與多種免疫病理過程[9, 10]。因此，以HMGB1為靶點治療相關疾病可能具有重要臨床價值。對乙酰氨基酚（APAP）在1955年被美國食品和藥物管理局批準作為兒童常用的解熱鎮痛藥，但大劑量的使用會導致一定的肝毒性和腎毒性[11]。本研究探討了HDN對APAP所致小鼠急性肝損傷的保護作用，并探討其機制。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
HDN、APAP均購自美國Sigma公司；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）購自天津市科密歐化學試劑有限公司；聯苯雙酯滴丸購自浙江萬邦藥業股份有限公司；丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）試劑盒、考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒均購自南京建成生物工程有限公司；總RNA提取試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司；逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）試劑盒購于寶生物工程（大連）有限公司；PCR引物由上海生工生物工程技術服務公司合成；兔抗鼠HMGB1多克隆抗體本室保存[12]；辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG購自上海碧云天生物技術有限公司。
1.2 動物
清潔級BALB/c小鼠，雄性，體質量18～22 g，武漢大學動物實驗中心提供，合格證號：SCXK（鄂）2008-0004。
1.3 方法
1.3.1 動物模型建立
48只雄性BALB/c小鼠隨機均勻分為6組，每組8只，分別為正常組、模型組、HDN組（劑量分別為500、250、125 mg/kg）、聯苯雙酯組（150 mg/kg）。HDN組分別灌胃不同濃度的HDN懸濁液，聯苯雙酯組灌胃等量聯苯雙酯溶液，正常組和模型組灌胃同體積的CMC-Na溶液，1次/d，連續10 d。末次給藥后禁食不禁水，2 h后除正常組外其余各組均腹腔注射APAP溶液150 mg/kg造模，正常組注射同體積的CMC-Na溶液。16 h后，眼球取血，處死小鼠。
1.3.2 相關指標的檢測
取血0.5～1.0 mL，室溫靜置30 min，4℃離心3 000 r/min×15 min，取上清液，運用自動生化分析儀檢測血清谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）。取一定量的肝左葉組織，加9倍重量冷生理鹽水制成10%肝勻漿，所有操作均在冰浴中進行。嚴格按照試劑盒說明書測定GSH活性和MDA含量。
1.3.3 肝臟病理學觀察及分級
取肝右葉用10%中性甲醛溶液固定，常規石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，光學顯微鏡下觀察肝臟病理組織學改變并分級。肝臟病理分級如下：0級：未見明顯病理損傷；1級：肝組織濁腫伴有散在的點狀壞死，匯管區少許炎性細胞浸潤；2級：肝細胞濁腫有點狀壞死及小灶性壞死，可見散在的肉芽腫形成，匯管區有大量炎性細胞浸潤；3級：肝細胞濁腫并伴有片狀壞死，肉芽腫形成，匯管區及周圍有大量炎性細胞浸潤。
1.3.4 免疫組織化學法檢測HMGB1的表達
石蠟切片常規二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，3% H2O2室溫孵育5～10 min，微波抗原修復，磷酸鹽緩沖液（PBS）浸泡5 min×1次，二抗正常血清封閉30 min，一抗孵育4℃過夜，PBS沖洗5 min×3次，羊抗鼠IgG孵育37℃30 min，鼠PAP孵育37℃ 30 min，PBS沖洗5 min×3次，二氨基聯苯胺顯色，蘇木精復染，自來水充分沖洗、脫水、透明、封片。顯微鏡觀察免疫組織化學肝組織切片。
1.3.5 RT-PCR法測定肝組織HMGB1
mRNA 用總RNA試劑盒提取總RNA，紫外分光光度計測定A260/A280比值，判斷其濃度和純度。嚴格按照RT-PCR試劑盒說明書逆轉錄為cDNA后進行擴增，-80℃保存。HMGB1上游引物：5’-GATGGGCAAAGGAGATCCTAAG-3’，下游引物：5’-TCACTTTTTTGTCTCCCCTTTGGG-3’；β-actin上游引物：5’-TGGAATCCTGTGGCATCCAT-3’，下游引物：5’-ACGCAGCTCAGTAA-3’。0.5 mL的PCR反應管中依次加入下列反應液：雙蒸水13.3 μL，10×Buffer 2.0 μL，脫氧核糖核苷三磷酸1.5 μL，HMGB1或β-actin引物各0.6 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，cDNA 1.5 μL，總體積20 μL，短暫離心后進行PCR。PCR擴增條件為HMGB1：94℃預變性5 min，94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，共30個循環，最后72℃延伸5 min，10℃保存；β-actin：94℃預變性5 min，94℃變性 30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個循環，最后72℃延伸7 min，10℃保存。取PCR產物7 μL在2%的瓊脂糖凝膠上樣電泳，用BIO-Rad凝膠成像系統分析電泳帶，β-actin作為內參照，以HMGB1/β-actin的比值作為HMGB1 mRNA相對表達量。
1.4 統計學方法
采用SPSS 17.0統計學軟件處理，實驗數據均以均數 ± 標準差表示，組間比較采用t檢驗，半定量資料采用Ridit分析。P值＜0.05為有統計學意義。
2 結果
2.1 HDN對小鼠血清ALT、AST水平的影響
模型組ALT、AST水平較正常組有顯著的升高（P＜0.01）；其他各實驗組血清ALT、AST水平較模型組均顯著降低（P＜0.01）。見表 1。
表1
各組小鼠血清ALT和AST（n=8，2.2 HDN對小鼠肝勻漿MDA、GSH的影響
與正常組相比，模型組肝勻漿GSH活力顯著降低，MDA含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，HDN 500 mg/kg濃度組、250 mg/kg濃度組和聯苯雙酯組GSH活力顯著升高（P＜0.01），MDA含量顯著降低（P＜0.01），以HDN 500 mg/kg濃度組和聯苯雙酯組效果最為顯著。HDN 100 mg/kg濃度組無明顯變化，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 2。
表2
各組小鼠肝勻漿MDA、GSH水平（n=8，2.3 HDN對小鼠肝臟病理變化的影響
光學顯微鏡下正常組小鼠肝組織結構清晰，肝細胞索圍繞中央靜脈呈放射狀整齊排列，未見明顯病理變化；模型組肝組織可見明顯以中央靜脈為中心的彌漫性大片壞死，肝細胞、肝索結構均消失，并伴有大量炎性細胞浸潤；聯苯雙酯組和HDN組肝細胞變性、壞死、炎性細胞浸潤程度較模型組均明顯減輕，其中聯苯雙酯組和HDN 500 mg/kg濃度組肝小葉結構基本正常，肝索排列較整齊，肝細胞水腫不明顯，炎性細胞浸潤較少，接近正常肝組織。各組病理分級Radit平均值＜0.500，病理變化較輕。見表 3、圖 1。
圖1
各組小鼠肝組織病理變化（HE×400） 1a.正常組結構清晰，未見明顯異常 1b.模型組肝組織可見明顯以中央靜脈為中心的彌漫性大片壞死，伴有大量炎性細胞浸潤 1c～1f. 其他各組肝組織較模型組損傷程度明顯減輕1c. HDN 500 mg/kg 濃度組 1d. HDN 250 mg/kg 濃度組 1e. HDN 125 mg/kg 濃度組 1f. 聯苯雙酯組 ? ?圖 2 各組小鼠肝臟HMGB1表達（免疫組織化學染色×400） 2a.正常組未見陽性細胞 2b.模型組HMGB1陽性細胞（白箭）明顯增多 2c. HDN 500 mg/kg濃度組陽性細胞（白箭）少見
表3
各組小鼠肝臟病理分級（n=8，2.4 免疫組織化學法分析HMGB1表達
HMGB1在正常肝組織中大多數表達在細胞核，在細胞質中不表達或少量表達。與正常組相比，模型組肝組織中HMGB1陽性細胞數明顯增多；與模型組相比，HDN高濃度組HMGB1陽性細胞數顯著減少。見圖 2。
2.5 RT-PCR測定肝勻漿HMGB1 mRNA轉錄水平
與正常組相比，模型組肝組織HMGB1 mRNA水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比，HDN各組和聯苯雙酯組可不同程度的降低HMGB1 mRNA水平，差異具有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05）。見圖 3。
圖3
各組小鼠肝組織HMGB1 mRNA轉錄水平 *與正常組比較， P＜0.01；#與模型組比較，P＜0.01。其中1為正常組，2為模型組， 3為HDN 500 mg/kg 濃度組，4為HDN 250 mg/kg 濃度組，5為HDN 125 mg/kg濃度組，6為聯苯雙酯組 3a. 電泳圖 3b. 條形統計圖
3 討論
APAP主要通過肝臟細胞色素P450代謝生成親電子產物乙酰苯醌亞胺（NAPQI），其可與細胞內多種生物活性大分子結合，并導致細胞內鈣升高和脂質過氧化反應，從而損傷肝細胞 [2]。大量研究證實，HDN對APAP所致的急性肝、腎損傷均有一定的保護作用[11]。本研究通過建立對APAP急性肝損傷動物模型，進一步探討HDN對APAP所致急性肝損傷的保護作用及相關機制。
本研究中，模型組血清ALT、AST明顯升高，病理切片顯示以中央靜脈為中心的彌漫性大片壞死，表明本研究成功建立急性肝損傷動物模型。肝臟脂質過氧化的程度可以通過脂質過氧化物等指標來評價。MDA是脂質過氧化的終產物，可嚴重破壞細胞膜結構，導致細胞腫脹、壞死，因此其組織含量的多少，可以間接反映肝細胞的損傷程度。GSH對于協調機體抗氧化過程起關鍵作用，與還原型GSH構成了抗氧化的第一道防線[13]。因此，測定肝勻漿GSH能夠直觀反映肝臟受損情況，其活力大小反映機體抗氧化和清除自由基的能力。本研究結果顯示，HDN能顯著降低血清ALT、AST水平和MDA含量，升高肝勻漿GSH活力，表明HDN對肝損傷保護作用機制可能與其抗氧化和清除自由基有關。HDN可能通過提高GSH活性，增強機體抗氧化和清除自由基的能力，降低肝細胞的脂質過氧化反應，從而對肝細胞產生保護作用。
HMGB1是一類在真核細胞中含量豐富的非組蛋白核蛋白，即核DNA結合蛋白，其在維持核小體結構，調控DNA的復制、轉錄、重組和修復中具有重要作用[14, 15]。HMGB1通過兩種機制釋放到細胞外，一種是通過受損組織中損傷或壞死細胞被動釋放，作為危險信號誘導其他細胞發生非生理性死亡；另一種是包括巨噬細胞和中性粒細胞在內的炎癥細胞主動分泌，其首先經乙酰化并由核內轉移至溶酶體內，繼而在三磷酸腺苷和溶血磷脂膽堿兩種分泌信號作用下轉移至細胞外[16, 17]。研究表明，HMGB1釋放到細胞外后，可作為炎癥介質，與多種炎癥介質相互誘生，參與多種病理生理過程，維持和放大炎癥效應[10]。在缺血-再灌注誘發肝損傷的實驗小鼠模型中，缺血-再灌注1 h后肝臟HMGB1蛋白表達增加，提示HMGB1參與了炎癥和器官損害的病理過程；給再灌注動物注射重組HMGB1則顯著增加血清肝酶譜水平并使肝損傷進一步惡化；而使用多克隆抗體阻斷HMGB1可保護小鼠免受肝缺血-再灌注損傷[18]。在Con A所致的急性肝損傷中，肝組織HMGB1 mRNA水平明顯增高，而外源性的HMGB1抗體可有效降低實驗小鼠的肝損傷[19]。這些研究結果均提示HMGB1參與促炎癥和器官損傷的病理過程。本研究發現，模型組小鼠肝組織HMGB1 mRNA水平明顯升高（P＜0.01），HDN組HMGB1 mRNA水平明顯降低（P＜0.01或0.05），HDN 500 mg/kg濃度組HMGB1陽性顆粒細胞數較模型組顯著減少，表明HDN減輕APAP所致急性肝損傷可能與其抑制HMGB1 mRNA轉錄和蛋白表達有關，但具體機制尚需進一步深入研究。
總之，HDN對APAP誘導小鼠急性肝損傷具有保護作用，可能與其抑制HMGB1 mRNA轉錄和釋放有關，具體機制尚需進一步深入研究。
