引用本文： 曹振昊, 田云虎, 馬璐璐, 趙厚嶺. 慢性壓迫背根神經節大鼠模型背根神經節Wnt5a的表達變化. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(11): 1392-1396. doi: 10.7507/1002-1892.20140302 復制
腰椎間盤突出癥是一種臨床常見疾病，突出的髓核組織壓迫神經根或背根神經節會導致下肢痛，通常稱為“神經根性疼痛”。許多研究利用神經根病大鼠模型證實了神經根性疼痛與脊髓或背根神經節的炎性反應有關，在背根神經節和脊髓的相應節段有炎性因子大量表達，其中TNF-α是最主要因子[1-3]。近年來，Wnt5a在炎性反應中的作用日益受到重視，但對Wnt5a在神經根性疼痛發病機制中的研究較少[4]。慢性壓迫背根神經節（chronic compression of dorsal root ganglia，CCD）大鼠模型可以很好地模擬這種神經根性疼痛[5]。本實驗選擇該動物模型，首先在蛋白與基因水平上檢測CCD大鼠模型背根神經節中Wnt5a的表達變化，通過使用依那西普抑制TNF-α的活性后再次檢測Wnt5a的表達，為進一步探索Wnt5a在神經根性疼痛中的作用以及TNF-α與Wnt5a在神經根病中的關系提供新思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SPF級成年雄性SD大鼠192只，體重180～220 g，由山東魯抗動物中心提供。大鼠于25℃條件下適應性飼養2周，定期消毒和通風。
依那西普（商品名：益賽普，25 mg粉劑；上海中信國建藥業股份有限公司）；兔抗大鼠Wnt5a多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；免疫組織化學染色試劑盒、DAB顯色液、生物素化山羊抗兔二抗工作液（北京中杉金橋生物技術有限公司）；逆轉錄試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；Premix Taq、DL1000 DNA Marker（大連寶生物工程有限公司）；von Frey纖維細絲（Stoelting公司，美國）。梯度PCR擴增儀（Bio-Rad公司，美國）；Leica CM1900恒溫冰凍切片機（Leica公司，德國）；Primer Premier5.0軟件（Premier公司，加拿大）；Gel圖像分析系統（Media Cybernetics公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
將SD大鼠隨機分為4組，每組48只，分別為假手術組（A組）、CCD組（B組）、CCD +生理鹽水組（C組）、CCD +依那西普組（D組）。B、C、D組按照Hu等[5]方法制備CCD模型：取SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，無菌條件下取俯臥位，剪毛并消毒L4～6范圍皮膚后，逐層切開皮膚、皮下組織，鈍性分離左側L5椎旁肌，暴露左側L5椎板和橫突；先用L型1 mL注射器鈍性針頭探入L5椎間孔，觸及背根神經節時左腿出現抽動；拔出1 mL注射器針頭后，將長3.5 mm、直徑0.6?mm的L型中空不銹鋼管緩緩插入L5椎間孔，觸及背根神經節后左腿會劇烈抽動，提示造模成功；將不銹鋼管固定，逐層縫合肌肉、皮下組織及皮膚。A組僅同上法暴露椎間孔、探針探入，不插入不銹鋼管。術后均肌肉注射10萬U青霉素鈉預防感染。C、D組造模后分別腹腔注射生理鹽水（5.5 mg/kg）和益賽普（5.5?mg/ kg）。
1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
觀察各組大鼠成活情況以及術后切口有無感染。
1.3.2 大鼠行為學檢測
各組于術后1、3、5、7?d分別取6只大鼠，檢測后足機械痛閾值[6]。檢測前先將大鼠放至底部為金屬網（網格大小為0.5?cm?×0.5?cm）的正方體透明籠（大小為25 cm×25 cm×25?cm）內，蓋以黑色板使其自然適應40 min。利用von Frey纖維細絲檢測大鼠后足機械痛閾值：以后足足心為刺激點，刺激后出現大鼠足回縮、抬足或舔足視為陽性反應；同一刺激強度下，5次刺激中出現3次陽性反應，所對應的纖維細絲克數即為大鼠后足機械痛閾值。為避免對大鼠造成創傷，刺激強度逐漸增高且纖維細絲最大克數不超過15?g，分別為1、2、4、6、8、10、15 g。每次更換不同克數纖維細絲時需等待5?min，以使大鼠恢復刺激前狀態。
1.3.3 免疫組織化學染色觀察
各組于術后3、7 d分別取6只大鼠，同上法麻醉后，經心臟依次灌注40℃生理鹽水200 mL和含4%多聚甲醛的PBS 300 mL，快速取出左側L5背根神經節，以含4%多聚甲醛的PBS固定6～8 h，含20%和30%蔗糖的PBS梯度沉糖，于恒溫冰凍切片機中連續冠狀切片，片厚10?μm。取冰凍切片采用SP法行背根神經節Wnt5a免疫組織化學染色。具體步驟：將冰凍切片室溫放置15 min；正常山羊血清37℃封閉30 min后，傾去多余血清，滴加兔抗大鼠Wnt5a多克隆抗體（1:200），4℃過夜；滴加生物素化山羊抗兔二抗工作液，37℃孵育60 min；滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育60 min；DAB避光顯色1～3 min。以上各步驟之間除山羊血清封閉外，均需用0.01 mol/L PBS沖洗。反應完畢后，切片行梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。每只大鼠隨機取5張切片，計數陽性細胞數，取均值。
1.3.4 RT-PCR檢測
各組于術后3、7 d分別取18只大鼠，同上法麻醉后取出L5背根神經節，TRIzol法提取組織總RNA，按逆轉錄試劑盒操作說明將2?μg總RNA進行逆轉錄和聚合酶鏈反應。按Primer Premier5.0軟件分析并設計引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列：Wnt5a上游5' -CATTGGAGAAGGCGCG-AAGAC-3' ，下游5' -AGTCCGGACTTGGGTCGATGT-3' ，產物長度644?bp；GAPDH上游5' -CTCATGACCACAG-TCCATGC-3' ，下游5' -TTCAGCTCTGGGATGACCTT-3' ，產物長度155?bp。PCR反應體系為50μL：Premix Taq 25μL，上、下游引物各1μL，模板2μL，加滅菌雙蒸水補足至50μL。PCR反應條件：94℃預變性5 min，94℃、30 s，61.8℃（Wnt5a）或56℃（GAPDH）、30 s，72℃、30 s，35個循環；72℃延伸10 min。PCR擴增產物行2%瓊脂糖凝膠電泳，利用Gel圖像分析系統分析電泳條帶，以目的基因與內參GAPDH基因條帶吸光度（A）值比值表示目的基因相對表達量。
1.4 統計學方法
采用SAS9.2統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
A組大鼠無死亡。B、C、D組早期手術時分別死亡4、5、7只大鼠，分析原因為造模時間過長，導致大鼠術中休克死亡；后期手術時給予烤燈照射，同時縮短手術時間，減小創傷，均無大鼠死亡發生；死亡大鼠均予以及時補充。早期造模大鼠D組術后出現切口感染，后期改進手術條件并切口局部給予抗生素粉劑預防感染后，無感染再發生。各組大鼠術后1 d時進食量及活動量較少，2?d后進食及活動量恢復正常。
2.2 大鼠行為學檢測
術后各時間點B、C組機械痛閾值均顯著低于A、D組，D組低于A組，差異均有統計學意義（P < 0.05）；B、C組間差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖 1。
圖1
術后各時間點各組機械痛閾值比較
Figure1.
Comparison of the mechanical pain threshold among groups at different time points after operation
2.3 免疫組織化學染色檢測
術后各時間點各組大鼠背根神經節的神經元均有棕褐色特異性免疫陽性物質沉積，且Wnt5a均表達于神經元的細胞質中。術后3 d，A組陽性細胞較少，神經元細胞質染色較淺；B、C組陽性細胞多于A組，且細胞質染色較A組深；D組陽性細胞較C組減少，神經元細胞質染色明顯淺于C組。術后7 d，A組陽性細胞較術后3 d稍增多，但細胞質染色仍較淺；B、C組陽性細胞較A組明顯增多，大、中、小神經元細胞質染色均明顯加深；D組陽性細胞較C組減少，且神經元細胞質染色明顯較C組淺。見圖 2。
圖2
術后各時間點各組免疫組織化學染色觀察（×400）?A組3 d ?B組3 d ?C組3 d ?D組3 d ? A組7 d ? B組7?d ? C組7 d ? D組7 d??圖 3?術后各時間點各組Wnt5a陽性細胞數比較??圖 4?RT-PCR檢測術后各時間點各組Wnt5a mRNA表達?M：Marker 1：A組3 d ?2：A組7 d ?3：B組3 d ?4：B組7 d ?5：C組3 d ?6：D組3 d ?7：C組7 d ?8：D組7 d??圖 5?術后各時間點各組Wnt5a mRNA相對表達量比較
Figure2.
Immunohistochemical staining observation in each group after operation (×400) ? Group A at 3 days ? Group B at 3 days ? Group C at 3 days ? Group D at 3 days ? Group A at 7 days ? Group B at 7 days ? Group C at 7 days ? Group D at 7 days??Fig.3?Comparison of the number of Wnt5a positive cells among groups after operation??Fig.4?Expression of Wnt5a mRNA in each group after operation by RT-PCR M: Marker 1: Group A at 3 days 2: Group A at 7 days 3: Group B at 3 days 4: Group B at 7 days 5: Group C at 3 days 6: Group D at 3 days 7: Group C at 7 days 8: Group D at 7 days??Fig.5?Comparison of the relative expression of Wnt5a mRNA among groups after operation
定量分析結果示，除A組外，術后7 d B、C、D組Wnt5a陽性細胞數均明顯多于術后3 d，差異有統計學意義（P < 0.05）。術后3、7 d，B、C組Wnt5a陽性細胞數顯著多于A、D組，D組多于A組，差異均有統計學意義（P < 0.05）；B、C組間差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖 3。
2.4 RT-PCR檢測
除A組外，B、C、D組術后7 d Wnt5a mRNA相對表達量均高于術后3 d，差異有統計學意義（P < 0.05）。術后3、7 d，B、C組Wnt5a mRNA相對表達量分別顯著高于A、D組，D組高于A組，差異均有統計學意義（P < 0.05）；B、C組間差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖 4、5。
3 討論
Wnt蛋白是一種高度保守的分泌性糖蛋白，目前在哺乳動物中發現了19種Wnt蛋白，Wnt蛋白和配體可與不同受體結合，發揮不同生物學作用。Wnt5a是Wnt蛋白家族中的重要一員，通常介導非經典通路。有研究表明[7]，在血管壁動脈粥樣硬化斑中有Wnt5a表達，且在動脈粥樣硬化患者的血清中也發現了Wnt5a蛋白。Lambert等[8]研究發現在骨關節炎的炎性滑膜結構中存在Wnt5a基因表達，說明Wnt5a與滑膜的炎性反應有密切關系。同時，在由革蘭陰性菌感染導致的敗血癥患者血清中也發現了Wnt5a大量表達[9]。Wnt5a可通過JNK信號轉導通路激活NF-κB通路，NF-κB是一種重要的核心轉錄調節因子，可促使炎性細胞合成TNF-α等炎性因子，從而促進炎性反應的發生。
各種原因導致的神經根病，基本都是由免疫因素或炎性因素介導[10-13]。有研究在病毒感染導致的慢性疼痛大鼠模型中發現了Wnt5a在背根神經節中的表達[14]。本研究擬通過免疫組織化學染色及RT-PCR檢測分別在蛋白及基因水平檢測背根神經節中Wnt5a的表達變化，研究Wnt5a在神經根病中發揮的作用。免疫組織化學染色結果示，術后3、7 d，B組Wnt5a陽性細胞數均明顯多于A組，且B組7 d時的Wnt5a陽性細胞數明顯多于3 d。RT-PCR檢測結果也與免疫組織化學染色結果吻合，提示術后3、7 d Wnt5a基因被激活并轉錄出mRNA，且7 d時mRNA相對表達量顯著高于術后3 d。術后3、7 d B組大鼠后足機械痛閾值低于A組，這與Wnt5a的表達變化可能有一定關聯。提示在神經根病發病早期，Wnt5a在背根神經節中表達明顯增加，其表達量增加可能與背根神經節的早期炎性反應及早期疼痛有關。
Wnt5a和TNF-α間存在重要聯系，在阿爾茨海默病中，Wnt5a可通過Aβ蛋白促進炎性因子TNF-α表達[15]。研究表明，TNF-α能促進體外培養的人BMSCs及大鼠髓核細胞中Wnt5a的表達[16-18]。動物實驗表明，TNF-α作為一種重要的炎性因子參與了神經根病的發病過程[19-20]。但在背根神經節的神經元中，Wnt5a與TNF-α的關系仍然未知，研究二者之間關系有助于了解神經根病炎性反應的發病機制。綜合以上資料，我們設計了大鼠腹腔注射依那西普抑制TNF-α后檢測Wnt5a表達變化，結果顯示與C組相比，D組術后3、7?d大鼠背根神經節細胞中Wnt5a蛋白與基因表達量均減少，表明阻斷TNF-α能夠抑制背根神經節中Wnt5a的表達；且D組術后3、7 d后足機械痛閾值均高于C組，初步表明TNF-α與Wnt5a之間存在一定關聯。Wnt5a在神經根炎性反應中發揮的作用值得進一步探討。
綜上述，本研究結果表明在CCD大鼠模型背根神經節中，Wnt5a表達較正常大鼠增加，抑制TNF-α后Wnt5a表達減少，但具體信號機制仍待進一步研究。提示在神經根病早期，可能通過阻斷Wnt5a信號通路中的某些環節，達到阻斷炎性發展的目的，減輕炎性反應在神經根病中的病理作用。
腰椎間盤突出癥是一種臨床常見疾病，突出的髓核組織壓迫神經根或背根神經節會導致下肢痛，通常稱為“神經根性疼痛”。許多研究利用神經根病大鼠模型證實了神經根性疼痛與脊髓或背根神經節的炎性反應有關，在背根神經節和脊髓的相應節段有炎性因子大量表達，其中TNF-α是最主要因子[1-3]。近年來，Wnt5a在炎性反應中的作用日益受到重視，但對Wnt5a在神經根性疼痛發病機制中的研究較少[4]。慢性壓迫背根神經節（chronic compression of dorsal root ganglia，CCD）大鼠模型可以很好地模擬這種神經根性疼痛[5]。本實驗選擇該動物模型，首先在蛋白與基因水平上檢測CCD大鼠模型背根神經節中Wnt5a的表達變化，通過使用依那西普抑制TNF-α的活性后再次檢測Wnt5a的表達，為進一步探索Wnt5a在神經根性疼痛中的作用以及TNF-α與Wnt5a在神經根病中的關系提供新思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SPF級成年雄性SD大鼠192只，體重180～220 g，由山東魯抗動物中心提供。大鼠于25℃條件下適應性飼養2周，定期消毒和通風。
依那西普（商品名：益賽普，25 mg粉劑；上海中信國建藥業股份有限公司）；兔抗大鼠Wnt5a多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；免疫組織化學染色試劑盒、DAB顯色液、生物素化山羊抗兔二抗工作液（北京中杉金橋生物技術有限公司）；逆轉錄試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；Premix Taq、DL1000 DNA Marker（大連寶生物工程有限公司）；von Frey纖維細絲（Stoelting公司，美國）。梯度PCR擴增儀（Bio-Rad公司，美國）；Leica CM1900恒溫冰凍切片機（Leica公司，德國）；Primer Premier5.0軟件（Premier公司，加拿大）；Gel圖像分析系統（Media Cybernetics公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
將SD大鼠隨機分為4組，每組48只，分別為假手術組（A組）、CCD組（B組）、CCD +生理鹽水組（C組）、CCD +依那西普組（D組）。B、C、D組按照Hu等[5]方法制備CCD模型：取SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，無菌條件下取俯臥位，剪毛并消毒L4～6范圍皮膚后，逐層切開皮膚、皮下組織，鈍性分離左側L5椎旁肌，暴露左側L5椎板和橫突；先用L型1 mL注射器鈍性針頭探入L5椎間孔，觸及背根神經節時左腿出現抽動；拔出1 mL注射器針頭后，將長3.5 mm、直徑0.6?mm的L型中空不銹鋼管緩緩插入L5椎間孔，觸及背根神經節后左腿會劇烈抽動，提示造模成功；將不銹鋼管固定，逐層縫合肌肉、皮下組織及皮膚。A組僅同上法暴露椎間孔、探針探入，不插入不銹鋼管。術后均肌肉注射10萬U青霉素鈉預防感染。C、D組造模后分別腹腔注射生理鹽水（5.5 mg/kg）和益賽普（5.5?mg/ kg）。
1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
觀察各組大鼠成活情況以及術后切口有無感染。
1.3.2 大鼠行為學檢測
各組于術后1、3、5、7?d分別取6只大鼠，檢測后足機械痛閾值[6]。檢測前先將大鼠放至底部為金屬網（網格大小為0.5?cm?×0.5?cm）的正方體透明籠（大小為25 cm×25 cm×25?cm）內，蓋以黑色板使其自然適應40 min。利用von Frey纖維細絲檢測大鼠后足機械痛閾值：以后足足心為刺激點，刺激后出現大鼠足回縮、抬足或舔足視為陽性反應；同一刺激強度下，5次刺激中出現3次陽性反應，所對應的纖維細絲克數即為大鼠后足機械痛閾值。為避免對大鼠造成創傷，刺激強度逐漸增高且纖維細絲最大克數不超過15?g，分別為1、2、4、6、8、10、15 g。每次更換不同克數纖維細絲時需等待5?min，以使大鼠恢復刺激前狀態。
1.3.3 免疫組織化學染色觀察
各組于術后3、7 d分別取6只大鼠，同上法麻醉后，經心臟依次灌注40℃生理鹽水200 mL和含4%多聚甲醛的PBS 300 mL，快速取出左側L5背根神經節，以含4%多聚甲醛的PBS固定6～8 h，含20%和30%蔗糖的PBS梯度沉糖，于恒溫冰凍切片機中連續冠狀切片，片厚10?μm。取冰凍切片采用SP法行背根神經節Wnt5a免疫組織化學染色。具體步驟：將冰凍切片室溫放置15 min；正常山羊血清37℃封閉30 min后，傾去多余血清，滴加兔抗大鼠Wnt5a多克隆抗體（1:200），4℃過夜；滴加生物素化山羊抗兔二抗工作液，37℃孵育60 min；滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育60 min；DAB避光顯色1～3 min。以上各步驟之間除山羊血清封閉外，均需用0.01 mol/L PBS沖洗。反應完畢后，切片行梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。每只大鼠隨機取5張切片，計數陽性細胞數，取均值。
1.3.4 RT-PCR檢測
各組于術后3、7 d分別取18只大鼠，同上法麻醉后取出L5背根神經節，TRIzol法提取組織總RNA，按逆轉錄試劑盒操作說明將2?μg總RNA進行逆轉錄和聚合酶鏈反應。按Primer Premier5.0軟件分析并設計引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列：Wnt5a上游5' -CATTGGAGAAGGCGCG-AAGAC-3' ，下游5' -AGTCCGGACTTGGGTCGATGT-3' ，產物長度644?bp；GAPDH上游5' -CTCATGACCACAG-TCCATGC-3' ，下游5' -TTCAGCTCTGGGATGACCTT-3' ，產物長度155?bp。PCR反應體系為50μL：Premix Taq 25μL，上、下游引物各1μL，模板2μL，加滅菌雙蒸水補足至50μL。PCR反應條件：94℃預變性5 min，94℃、30 s，61.8℃（Wnt5a）或56℃（GAPDH）、30 s，72℃、30 s，35個循環；72℃延伸10 min。PCR擴增產物行2%瓊脂糖凝膠電泳，利用Gel圖像分析系統分析電泳條帶，以目的基因與內參GAPDH基因條帶吸光度（A）值比值表示目的基因相對表達量。
1.4 統計學方法
采用SAS9.2統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
A組大鼠無死亡。B、C、D組早期手術時分別死亡4、5、7只大鼠，分析原因為造模時間過長，導致大鼠術中休克死亡；后期手術時給予烤燈照射，同時縮短手術時間，減小創傷，均無大鼠死亡發生；死亡大鼠均予以及時補充。早期造模大鼠D組術后出現切口感染，后期改進手術條件并切口局部給予抗生素粉劑預防感染后，無感染再發生。各組大鼠術后1 d時進食量及活動量較少，2?d后進食及活動量恢復正常。
2.2 大鼠行為學檢測
術后各時間點B、C組機械痛閾值均顯著低于A、D組，D組低于A組，差異均有統計學意義（P < 0.05）；B、C組間差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖 1。
圖1
術后各時間點各組機械痛閾值比較
Figure1.
Comparison of the mechanical pain threshold among groups at different time points after operation
2.3 免疫組織化學染色檢測
術后各時間點各組大鼠背根神經節的神經元均有棕褐色特異性免疫陽性物質沉積，且Wnt5a均表達于神經元的細胞質中。術后3 d，A組陽性細胞較少，神經元細胞質染色較淺；B、C組陽性細胞多于A組，且細胞質染色較A組深；D組陽性細胞較C組減少，神經元細胞質染色明顯淺于C組。術后7 d，A組陽性細胞較術后3 d稍增多，但細胞質染色仍較淺；B、C組陽性細胞較A組明顯增多，大、中、小神經元細胞質染色均明顯加深；D組陽性細胞較C組減少，且神經元細胞質染色明顯較C組淺。見圖 2。
圖2
術后各時間點各組免疫組織化學染色觀察（×400）?A組3 d ?B組3 d ?C組3 d ?D組3 d ? A組7 d ? B組7?d ? C組7 d ? D組7 d??圖 3?術后各時間點各組Wnt5a陽性細胞數比較??圖 4?RT-PCR檢測術后各時間點各組Wnt5a mRNA表達?M：Marker 1：A組3 d ?2：A組7 d ?3：B組3 d ?4：B組7 d ?5：C組3 d ?6：D組3 d ?7：C組7 d ?8：D組7 d??圖 5?術后各時間點各組Wnt5a mRNA相對表達量比較
Figure2.
Immunohistochemical staining observation in each group after operation (×400) ? Group A at 3 days ? Group B at 3 days ? Group C at 3 days ? Group D at 3 days ? Group A at 7 days ? Group B at 7 days ? Group C at 7 days ? Group D at 7 days??Fig.3?Comparison of the number of Wnt5a positive cells among groups after operation??Fig.4?Expression of Wnt5a mRNA in each group after operation by RT-PCR M: Marker 1: Group A at 3 days 2: Group A at 7 days 3: Group B at 3 days 4: Group B at 7 days 5: Group C at 3 days 6: Group D at 3 days 7: Group C at 7 days 8: Group D at 7 days??Fig.5?Comparison of the relative expression of Wnt5a mRNA among groups after operation
定量分析結果示，除A組外，術后7 d B、C、D組Wnt5a陽性細胞數均明顯多于術后3 d，差異有統計學意義（P < 0.05）。術后3、7 d，B、C組Wnt5a陽性細胞數顯著多于A、D組，D組多于A組，差異均有統計學意義（P < 0.05）；B、C組間差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖 3。
2.4 RT-PCR檢測
除A組外，B、C、D組術后7 d Wnt5a mRNA相對表達量均高于術后3 d，差異有統計學意義（P < 0.05）。術后3、7 d，B、C組Wnt5a mRNA相對表達量分別顯著高于A、D組，D組高于A組，差異均有統計學意義（P < 0.05）；B、C組間差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖 4、5。
3 討論
Wnt蛋白是一種高度保守的分泌性糖蛋白，目前在哺乳動物中發現了19種Wnt蛋白，Wnt蛋白和配體可與不同受體結合，發揮不同生物學作用。Wnt5a是Wnt蛋白家族中的重要一員，通常介導非經典通路。有研究表明[7]，在血管壁動脈粥樣硬化斑中有Wnt5a表達，且在動脈粥樣硬化患者的血清中也發現了Wnt5a蛋白。Lambert等[8]研究發現在骨關節炎的炎性滑膜結構中存在Wnt5a基因表達，說明Wnt5a與滑膜的炎性反應有密切關系。同時，在由革蘭陰性菌感染導致的敗血癥患者血清中也發現了Wnt5a大量表達[9]。Wnt5a可通過JNK信號轉導通路激活NF-κB通路，NF-κB是一種重要的核心轉錄調節因子，可促使炎性細胞合成TNF-α等炎性因子，從而促進炎性反應的發生。
各種原因導致的神經根病，基本都是由免疫因素或炎性因素介導[10-13]。有研究在病毒感染導致的慢性疼痛大鼠模型中發現了Wnt5a在背根神經節中的表達[14]。本研究擬通過免疫組織化學染色及RT-PCR檢測分別在蛋白及基因水平檢測背根神經節中Wnt5a的表達變化，研究Wnt5a在神經根病中發揮的作用。免疫組織化學染色結果示，術后3、7 d，B組Wnt5a陽性細胞數均明顯多于A組，且B組7 d時的Wnt5a陽性細胞數明顯多于3 d。RT-PCR檢測結果也與免疫組織化學染色結果吻合，提示術后3、7 d Wnt5a基因被激活并轉錄出mRNA，且7 d時mRNA相對表達量顯著高于術后3 d。術后3、7 d B組大鼠后足機械痛閾值低于A組，這與Wnt5a的表達變化可能有一定關聯。提示在神經根病發病早期，Wnt5a在背根神經節中表達明顯增加，其表達量增加可能與背根神經節的早期炎性反應及早期疼痛有關。
Wnt5a和TNF-α間存在重要聯系，在阿爾茨海默病中，Wnt5a可通過Aβ蛋白促進炎性因子TNF-α表達[15]。研究表明，TNF-α能促進體外培養的人BMSCs及大鼠髓核細胞中Wnt5a的表達[16-18]。動物實驗表明，TNF-α作為一種重要的炎性因子參與了神經根病的發病過程[19-20]。但在背根神經節的神經元中，Wnt5a與TNF-α的關系仍然未知，研究二者之間關系有助于了解神經根病炎性反應的發病機制。綜合以上資料，我們設計了大鼠腹腔注射依那西普抑制TNF-α后檢測Wnt5a表達變化，結果顯示與C組相比，D組術后3、7?d大鼠背根神經節細胞中Wnt5a蛋白與基因表達量均減少，表明阻斷TNF-α能夠抑制背根神經節中Wnt5a的表達；且D組術后3、7 d后足機械痛閾值均高于C組，初步表明TNF-α與Wnt5a之間存在一定關聯。Wnt5a在神經根炎性反應中發揮的作用值得進一步探討。
綜上述，本研究結果表明在CCD大鼠模型背根神經節中，Wnt5a表達較正常大鼠增加，抑制TNF-α后Wnt5a表達減少，但具體信號機制仍待進一步研究。提示在神經根病早期，可能通過阻斷Wnt5a信號通路中的某些環節，達到阻斷炎性發展的目的，減輕炎性反應在神經根病中的病理作用。
