引用本文： 王淞, 粟梅蘭, 楊華超, 龍剛, 唐振瑞, 黃文. 人臍帶MSCs-海藻酸鹽凝膠敷料的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(9): 1137-1143. doi: 10.7507/1002-1892.20150247 復制
外科創傷是指正常組織結構完整性被破壞，從而導致相應功能受損的病理現象。創傷會導致血管內皮細胞損傷，機體釋放多種細胞因子，產生一系列炎性反應。其中VEGF能特異性地作用于血管內皮細胞，使之增殖、遷移和形成管腔，促使毛細血管通透性增加及肉芽組織形成，對傷口的愈合至關重要[1]。此外，傷口愈合也受到多種因素影響，溫暖、濕潤的微環境有利于其愈合[2]。因此，理想的傷口敷料應具備一些關鍵物理特性，如良好的通透性、貼合性和疏水性，以及防腐性和可生物降解性等[3]。海藻酸鈉是一種天然高分子化合物，可與Ca2+結合形成對組織細胞無損害的海藻酸鈣凝膠，并能最大程度模擬體內微環境，為細胞提供與體內相似的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）及黏附結構[4-6]。同時，海藻酸鹽能刺激人單核細胞產生可促進傷口愈合的細胞因子，如TNF-α等，因而常被用作傷口敷料及藥物轉運體[7-10]。
人臍帶MSCs（human umbilical cord MSCs，hUCMSCs）是存在于人臍帶Wharton膠及血管外周組織中的一種多能成體干細胞，它除了具備胚胎干細胞的基本特征外，還具有一定的免疫調節性[11]，并能分泌血管生成所必需的VEGF等重要生長因子，目前已被成功應用于急、慢性創傷的治療[12-13]。本研究以海藻酸鈣凝膠為支架，對hUCMSCs 進行三維培養，并將細胞-凝膠支架復合物移植于動物皮膚創面，探索其作為傷口敷料的可行性。
1 材料與方法
1.1 實驗標本及主要試劑、儀器
人臍帶標本來自重慶醫科大學附屬第一醫院健康足月剖宮產新生兒，標本采集前均經產婦及其家屬同意，并簽署知情同意書。8周齡Balb/c雄性小鼠32只，體質量19～21 g，由重慶醫科大學動物實驗研究中心提供，并經過動物倫理委員會審核認證。
FBS、DMEM/F12培養基（GIBCO公司，美國）；含0.01% EDTA的0.25%胰蛋白酶（HyClone公司，美國）；小鼠抗人IgG流式抗體（BD公司，美國）；海藻酸鈉、無水CaCl2、檸檬酸鈉（Sigma公司，英國）；小鼠抗人VEGF的ELISA試劑盒、兔抗小鼠VEGF及CD31免疫組織化學試劑盒、山羊抗兔IgG單克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）。
細胞培養箱、自動酶標儀（Thermo公司，美國）；高速離心機、流式細胞儀（Beckman公司，美國）；倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；Image J軟件（美國國立衛生研究院）。
1.2 hUCMSCs體外分離培養及鑒定
1.2.1 細胞分離培養
取3～4 cm長臍帶，用0.01 mol/L PBS緩沖液沖洗，盡量去除臍帶內殘存血液；棄臍帶外膜及動、靜脈，保留Wharton膠及血管周圍組織，剪成約1 mm×1 mm×1 mm碎片；移入已用10%FBS培養液潤濕的培養瓶底，組織塊間距離約0.5 cm。將培養瓶倒置于37℃、5%CO2及飽和濕度孵育箱固定1～2 h；滴加適量10%FBS培養液，以剛好淹沒組織塊為宜，繼續培養。每隔3～4 d換液1次，首次半量換液，之后全量換液。待細胞達80%以上融合時，用0.25%胰蛋白酶消化后，按1∶2比例傳代。
1.2.2 細胞鑒定
取第4代細胞，以流式細胞儀檢測細胞表面標志物表達情況，顯示細胞表達基質細胞及黏附分子標記CD29、CD44和CD105，不表達造血干細胞標記CD45；行成骨、成脂誘導培養后，分別經茜素紅及油紅O染色呈陽性。以上結果提示細胞符合hUCMSCs特征。
1.3 細胞-支架復合物制備及觀測
1.3.1 細胞-支架復合物制備
配制150 mmol/L海藻酸鈉溶液和300 mmol/L CaCl2溶液各100 mL，調節pH值為7.4，高壓蒸汽滅菌后備用。收集對數生長期第4代hUCMSCs，用10%FBS培養液重懸細胞。將細胞懸液移至6孔板，每孔細胞約2×105個。每孔加入海藻酸鈉溶液3 mL，用無菌小玻璃棒攪拌，使細胞與海藻酸鈉充分混合。然后沿孔板一側加入CaCl2溶液3 mL，待海藻酸與Ca2+充分結合后（即凝膠形成，約需2 min），吸去孔內剩余液體，用無血清培養基洗滌凝膠。每孔內加入10%FBS培養液2 mL，置于37℃、5%CO2及飽和濕度孵育箱培養，每3天換液1次。倒置相差顯微鏡下觀察細胞在凝膠支架中的生長情況。以在6孔板中常規培養的細胞作為對照組。
1.3.2 VEGF檢測與細胞計數
培養第0、3、6、9天，實驗組及對照組各取3孔，收集各孔上清液，以離心半徑5 cm，1 000 r/min離心5 min，去除沉淀。按照小鼠抗人VEGF的ELISA試劑盒說明書檢測上清液中VEGF含量。
配制200 mmol/L檸檬酸鈉溶液100 mL，調節pH值為7.4，高壓蒸汽滅菌后備用。培養第0、3、6、9天實驗組及對照組各取3孔，移去上清液。將實驗組的細胞-支架復合物用PBS緩沖液洗滌2～3次，加入檸檬酸鈉溶液約1.5 mL（液體淹沒整個凝膠），于37℃、5%CO2及飽和濕度孵育箱孵育30 min，直至凝膠完全溶解。將細胞混合液以離心半徑5 cm，1 500 r/min離心8～10 min，用PBS緩沖液清洗3 次。將實驗組細胞團塊及對照組細胞用0.25%胰蛋白酶消化成單個細胞，熒光標記后采用流式細胞儀進行細胞計數，取均值。
1.3.3 細胞遷移能力檢測
收集對數生長期第4 代hUCMSCs，用PBS洗滌1～2次，再以無血清培養基重懸細胞，調整細胞濃度為4×105個/mL備用。① 取24孔板及Transwell小室3個，向小室內加入150 mmol/L海藻酸鈉溶液及細胞懸液各100 μL，攪拌混勻；② 將小室緩慢放入盛有300 mmol/L CaCl2溶液的24孔板中，待海藻酸與Ca2+充分結合成凝膠（約2 min）后取出小室，用無血清培養基沖洗凝膠及小室；③ 將小室放入盛有800 μL 10%FBS培養液的24孔板，于37℃、5%CO2及飽和濕度孵育箱里培養；④ 每隔24 h觀察凝膠中細胞的遷移情況，標記顯微鏡初始焦距，從上至下調整焦距，間隔1～2 mm，將每個凝膠分為4層（第1～4層）。各層于0、24、48 h隨機取5個視野，于400倍顯微鏡下觀察細胞并計數。
1.4 動物實驗
1.4.1 全層皮膚缺損小鼠模型制備及分組
按照1.3.1方法制作hUCMSCs-海藻酸鈣凝膠復合物，加入10%FBS培養液2 mL；另將海藻酸鈉溶液與CaCl2溶液按1∶1體積比混合成膠后，分別與細胞上清液、10%FBS培養液及0.01 mol/L PBS緩沖液2 mL共培養。取Balb/c雄性小鼠32只，腹腔注射10%水合氯醛（0.005 mL/g）麻醉，背部皮膚脫毛，用眼科剪制作深達皮膚全層及肌筋膜、直徑1.2～1.5 cm的圓形皮膚缺損（圖 1 a），以內徑為2 cm的硬質塑料環固定創面（圖 1 b）。根據創面修復方法不同，將小鼠模型隨機分為4組，每組8只。創面分別以hUCMSCs-海藻酸鈣凝膠復合物（MSC-凝膠組）、細胞上清液-海藻酸鈣凝膠復合物（CS-凝膠組）、10%FBS-海藻酸鈣凝膠復合物（FBS-凝膠組）及0.01 mol/ L PBS-海藻酸鈣凝膠復合物（PBS-凝膠組）覆蓋（圖 1 c）。凝膠外均以透明靜脈輸液固定護貼遮蓋固定（圖 1 d）。小鼠于相同條件下單籠飼養，凝膠敷料于術后第3天更換1次。
圖1
小鼠全層皮膚缺損模型制備及修復 ? 背部圓形皮膚缺損 ? 硬質塑料環固定創面 ? hUCMSCs-海藻酸鈣凝膠復合物覆蓋創面 ? 靜脈輸液固定護貼遮蓋固定 ? ?1.4.2 觀測指標
① 創面愈合率測量：觀察記錄各組動物創面愈合情況，于第5、10、15天用Image J軟件測量創面面積，并按照以下公式計算創面愈合率： （初始創面面積－測量日創面面積）/初始創面面積 ×100%。 ② 組織學觀察：術后第15天斷頸處死全部小鼠，完整切取創面皮膚標本，常規行石蠟切片，片厚5 μm。取部分切片行HE染色，鏡下觀察新生皮膚結構特征。③ 免疫組織化學染色：另取石蠟切片行免疫組織化學染色，檢測皮膚VEGF表達情況。具體步驟：切片脫蠟、水化，滅活內源性酶，抗原熱修復，封閉液封片，滴加兔抗小鼠VEGF單克隆抗體（一抗）；洗滌切片，滴加山羊抗兔IgG單克隆抗體（二抗）；DAB顯色，蘇木精復染，脫水、封片后于鏡下觀察、拍照。取剩余石蠟切片采用CD31免疫組織化學試劑盒同上法檢測CD31標記血管內皮細胞。以細胞呈棕色染色作為陽性表達，于200倍鏡下于對應染色切片隨機取5個視野觀察CD31陽性表達細胞，行毛細血管計數；取5個視野用Image J軟件計數VEGF陽性表達細胞。
1.5 統計學方法
采用SPSLS.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni事后檢驗；檢驗水準α= 0.05。
2 結果
2.1 hUCMSCs與凝膠支架共培養觀察
2.1.1 凝膠支架中細胞生長特征
倒置相差顯微鏡下觀察示，細胞種植于凝膠支架3 h后，可見細胞呈單個圓形或橢圓形，表面不規則（圖 2 a）；第3天細胞呈克隆樣生長，每簇由數個細胞（2～7個）組成（圖 2 b）；第6天和第9天可見細胞呈葡萄樣生長，細胞間聯系緊密（圖 2 c、d）。對照組細胞培養3 h后開始貼壁，呈扁橢圓形（圖 3 a）；第3天細胞呈長梭形生長，平鋪于板底（圖 3 b）；第6天細胞已達100%融合（圖 3 c）；第9天細胞大量死亡或變形（圖 3 d）。
2.1.2 VEGF檢測與細胞計數
ELISA檢測示：實驗組及對照組上清液中VEGF含量分別于第6天及第3天達峰值，各組組內各時間點間比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。培養第3天實驗組VEGF表達量明顯低于對照組（P＜0.05）；之后實驗組表達量逐漸增加，第6、9天時明顯高于對照組，比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖 4。
流式細胞計數顯示：兩組細胞數量均于第6天達峰值；兩組第6、9天細胞均顯著多于第3天，差異有統計學意義（P＜0.05）；第9天時對照組細胞較第6天明顯減少（P＜0.05），而實驗組細胞與第6天比較差異無統計學意義（P＞0.05）。培養第3天實驗組細胞明顯少于對照組（P＜0.05），第6天兩組差異無統計學意義（P＞0.05），而第9天實驗組細胞明顯多于對照組（P＜0.05）。見圖 5。
2.1.3 細胞遷移能力檢測
培養0 h時，各層細胞數量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。隨培養時間延長，細胞由凝膠上層（第1、2層）逐漸向下層（第3、4層）遷移，24、48 h時各層細胞數量存在顯著差異，凝膠下層的細胞數量明顯多于凝膠上層，比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖 6。經過7 d觀察未見細胞穿過整個凝膠遷移至小室底膜。
圖6
兩組各時間點細胞遷移計數 ? ?2.2 動物實驗觀察
2.2.1 創面愈合率測量
各組動物均存活至實驗完成。其中FBS-凝膠組中2只小鼠創面發生感染，未經特殊處理，自行好轉。隨時間延長，各組創面均逐漸愈合，組內各時間點間創面愈合率比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。其中MSC-凝膠組及CS-凝膠組創面愈合良好，第5、10、15天創面愈合率顯著高于FBS-凝膠組及PBS-凝膠組，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；而前兩組間及后兩組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖 7及表 1。
表1
各組術后各時間點創面愈合率比較（n=8，%，2.2.2 組織學觀察
鏡下觀察示，MSC-凝膠組與CS-凝膠組創面皮膚的鱗狀上皮、成纖維細胞、皮脂腺及毛細血管均較FBS-凝膠組及PBS-凝膠組多，且排列較整齊，表皮層與其下的纖維結締組織結合較緊密（圖 8）。
2.2.3 免疫組織化學染色觀察
鏡下可見各組VEGF廣泛表達于真皮層細胞及細胞外基質中，尤其多見于新生血管的內皮細胞（圖 9）。其中，MSCs-凝膠組和CS-凝膠組的VEGF陽性表達細胞分別為（144.60±18.84）個及（152.80±14.13）個，明顯高于FBS-凝膠組及PBS-凝膠組的（61.60±14.54）個及（56.40± 6.88）個，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；而前兩組間及后兩組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。MSCs-凝膠組和CS-凝膠組的毛細血管數分別為（20.60±4.51）個及（19.20±3.90）個，明顯高于FBS-凝膠組及PBS-凝膠組的（8.00±1.58）個及（9.80± 3.42） 個，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；而前兩組間及后兩組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。
3 討論
傷口愈合涉及到一系列相互重疊和相互關聯的階段性病理變化，在愈合過程中，許多細胞和基質成分共同參與了受傷組織的更換和缺損組織的重建[14]。現代重建醫學與組織工程的基本策略是：從活體組織分離細胞，在體外擴增后將其種植于特制的三維支架材料，再以細胞或細胞支架復合物修復損傷組織[15]。
海藻酸鈣凝膠對組織細胞無毒性，且具有一定的可生物降解性[16-17]，因而被廣泛應用于細胞培養。據報道，由濃度為100～150 mmol/L的海藻酸鈉所制得的海藻酸鈣凝膠多孔支架最適合細胞黏附、增殖及表達ECM，且該濃度范圍的凝膠孔徑較均勻（50～200 μm），機械強度較好[18]。本研究將hUC MSCs種植于由150 mmol/L海藻酸鈉制備的凝膠支架中，細胞生長良好，在無消化傳代條件下可生長增殖達1周以上。在凝膠系統中，細胞呈葡萄樣生長，該生長方式與傳統培養（呈長梭形）明顯不同。通過細胞計數，發現實驗組細胞數量于第3天后迅速上升，于第6天與對照組一致并共同達到高峰，第6天后對照組細胞逐漸死亡，而實驗組細胞仍維持其生長狀態。以上結果表明，hUCMSCs在海藻酸鈣凝膠支架中保持了活性，甚至能在立體環境中較長時間地生長、增殖。
創傷是外科常見病，組織工程中常用干細胞治療損傷嚴重或面積較大的急、慢性創傷。干細胞療法的作用機制主要有兩種理論：一種是細胞替代理論[19]，即干細胞通過定向分化方式，從結構及功能上替代宿主的缺損細胞或組織；另一種是旁分泌理論[13]，即干細胞通過分泌某些細胞因子激活特定的信號通路，從而促使缺損組織的修復與重建。然而，其具體作用機制尚存在爭議，目前國外研究結論更偏向于后一種，并認為在眾多細胞因子中以VEGF尤為重要。本研究細胞計數及VEGF檢測結果顯示，第3天實驗組細胞數量及VEGF表達量均明顯低于對照組。其原因可能為hUCMSCs種植于海藻酸鈣凝膠支架后的前3天，細胞處于適應階段，生長較緩慢，故實驗組VEGF表達量相對較低；另外，在收集細胞上清液時，因部分VEGF停留在凝膠支架中未被檢測到，以致實驗組的VEGF表達量相對較少。隨著培養時間增加，第6天和第9天實驗組細胞VEGF表達量明顯高于對照組。表明細胞在海藻酸鈣凝膠中更適合長時間地生長增殖，并發揮其功 能。
細胞遷移實驗觀察見，hUCMSCs在海藻酸鈣凝膠支架中雖具有一定的遷移能力，但尚不能從凝膠支架中遷移出。表明海藻酸鈣凝膠支架雖能為細胞的生長增殖提供合適的孔徑或空間，卻沒有足夠大的通道允許細胞自由遷移。然而，細胞可在凝膠支架中良好地生長，說明該支架具有較好的通透性，液體中的氧氣及細胞因子等營養成分能自由通過凝膠系統[20]。
進一步動物實驗表明，hUCMSCs及其上清液與海藻酸鈣凝膠形成的復合物可顯著促進小鼠創面愈合，且該兩組愈合情況無明顯差異，我們認為這可能與hUCMSCs是通過分泌某些細胞因子促進了創面修復有關。溫暖、濕潤的微環境有利于傷口愈合[2]，本研究將細胞-海藻酸鈣凝膠復合物置于動物皮膚缺損處，該復合物不但具有傷口防護作用，還可以保持傷口局部濕潤。同時，在創傷初期，傷口周圍的滲出液或血液對凝膠中的hUCMSCs是一種良好的培養基，從而可通過旁分泌機制[13, 21]對創傷組織進行持續地修復重建，促進傷口快速愈合。
綜上述，hUCMSCs能在海藻酸鈣凝膠中較長時間地分裂增殖，并較持久地分泌表達傷口愈合所必需的生長因子VEGF，為hUCMSCs-海藻酸鹽敷料的臨床應用提供了理論依據。
外科創傷是指正常組織結構完整性被破壞，從而導致相應功能受損的病理現象。創傷會導致血管內皮細胞損傷，機體釋放多種細胞因子，產生一系列炎性反應。其中VEGF能特異性地作用于血管內皮細胞，使之增殖、遷移和形成管腔，促使毛細血管通透性增加及肉芽組織形成，對傷口的愈合至關重要[1]。此外，傷口愈合也受到多種因素影響，溫暖、濕潤的微環境有利于其愈合[2]。因此，理想的傷口敷料應具備一些關鍵物理特性，如良好的通透性、貼合性和疏水性，以及防腐性和可生物降解性等[3]。海藻酸鈉是一種天然高分子化合物，可與Ca2+結合形成對組織細胞無損害的海藻酸鈣凝膠，并能最大程度模擬體內微環境，為細胞提供與體內相似的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）及黏附結構[4-6]。同時，海藻酸鹽能刺激人單核細胞產生可促進傷口愈合的細胞因子，如TNF-α等，因而常被用作傷口敷料及藥物轉運體[7-10]。
人臍帶MSCs（human umbilical cord MSCs，hUCMSCs）是存在于人臍帶Wharton膠及血管外周組織中的一種多能成體干細胞，它除了具備胚胎干細胞的基本特征外，還具有一定的免疫調節性[11]，并能分泌血管生成所必需的VEGF等重要生長因子，目前已被成功應用于急、慢性創傷的治療[12-13]。本研究以海藻酸鈣凝膠為支架，對hUCMSCs 進行三維培養，并將細胞-凝膠支架復合物移植于動物皮膚創面，探索其作為傷口敷料的可行性。
1 材料與方法
1.1 實驗標本及主要試劑、儀器
人臍帶標本來自重慶醫科大學附屬第一醫院健康足月剖宮產新生兒，標本采集前均經產婦及其家屬同意，并簽署知情同意書。8周齡Balb/c雄性小鼠32只，體質量19～21 g，由重慶醫科大學動物實驗研究中心提供，并經過動物倫理委員會審核認證。
FBS、DMEM/F12培養基（GIBCO公司，美國）；含0.01% EDTA的0.25%胰蛋白酶（HyClone公司，美國）；小鼠抗人IgG流式抗體（BD公司，美國）；海藻酸鈉、無水CaCl2、檸檬酸鈉（Sigma公司，英國）；小鼠抗人VEGF的ELISA試劑盒、兔抗小鼠VEGF及CD31免疫組織化學試劑盒、山羊抗兔IgG單克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）。
細胞培養箱、自動酶標儀（Thermo公司，美國）；高速離心機、流式細胞儀（Beckman公司，美國）；倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；Image J軟件（美國國立衛生研究院）。
1.2 hUCMSCs體外分離培養及鑒定
1.2.1 細胞分離培養
取3～4 cm長臍帶，用0.01 mol/L PBS緩沖液沖洗，盡量去除臍帶內殘存血液；棄臍帶外膜及動、靜脈，保留Wharton膠及血管周圍組織，剪成約1 mm×1 mm×1 mm碎片；移入已用10%FBS培養液潤濕的培養瓶底，組織塊間距離約0.5 cm。將培養瓶倒置于37℃、5%CO2及飽和濕度孵育箱固定1～2 h；滴加適量10%FBS培養液，以剛好淹沒組織塊為宜，繼續培養。每隔3～4 d換液1次，首次半量換液，之后全量換液。待細胞達80%以上融合時，用0.25%胰蛋白酶消化后，按1∶2比例傳代。
1.2.2 細胞鑒定
取第4代細胞，以流式細胞儀檢測細胞表面標志物表達情況，顯示細胞表達基質細胞及黏附分子標記CD29、CD44和CD105，不表達造血干細胞標記CD45；行成骨、成脂誘導培養后，分別經茜素紅及油紅O染色呈陽性。以上結果提示細胞符合hUCMSCs特征。
1.3 細胞-支架復合物制備及觀測
1.3.1 細胞-支架復合物制備
配制150 mmol/L海藻酸鈉溶液和300 mmol/L CaCl2溶液各100 mL，調節pH值為7.4，高壓蒸汽滅菌后備用。收集對數生長期第4代hUCMSCs，用10%FBS培養液重懸細胞。將細胞懸液移至6孔板，每孔細胞約2×105個。每孔加入海藻酸鈉溶液3 mL，用無菌小玻璃棒攪拌，使細胞與海藻酸鈉充分混合。然后沿孔板一側加入CaCl2溶液3 mL，待海藻酸與Ca2+充分結合后（即凝膠形成，約需2 min），吸去孔內剩余液體，用無血清培養基洗滌凝膠。每孔內加入10%FBS培養液2 mL，置于37℃、5%CO2及飽和濕度孵育箱培養，每3天換液1次。倒置相差顯微鏡下觀察細胞在凝膠支架中的生長情況。以在6孔板中常規培養的細胞作為對照組。
1.3.2 VEGF檢測與細胞計數
培養第0、3、6、9天，實驗組及對照組各取3孔，收集各孔上清液，以離心半徑5 cm，1 000 r/min離心5 min，去除沉淀。按照小鼠抗人VEGF的ELISA試劑盒說明書檢測上清液中VEGF含量。
配制200 mmol/L檸檬酸鈉溶液100 mL，調節pH值為7.4，高壓蒸汽滅菌后備用。培養第0、3、6、9天實驗組及對照組各取3孔，移去上清液。將實驗組的細胞-支架復合物用PBS緩沖液洗滌2～3次，加入檸檬酸鈉溶液約1.5 mL（液體淹沒整個凝膠），于37℃、5%CO2及飽和濕度孵育箱孵育30 min，直至凝膠完全溶解。將細胞混合液以離心半徑5 cm，1 500 r/min離心8～10 min，用PBS緩沖液清洗3 次。將實驗組細胞團塊及對照組細胞用0.25%胰蛋白酶消化成單個細胞，熒光標記后采用流式細胞儀進行細胞計數，取均值。
1.3.3 細胞遷移能力檢測
收集對數生長期第4 代hUCMSCs，用PBS洗滌1～2次，再以無血清培養基重懸細胞，調整細胞濃度為4×105個/mL備用。① 取24孔板及Transwell小室3個，向小室內加入150 mmol/L海藻酸鈉溶液及細胞懸液各100 μL，攪拌混勻；② 將小室緩慢放入盛有300 mmol/L CaCl2溶液的24孔板中，待海藻酸與Ca2+充分結合成凝膠（約2 min）后取出小室，用無血清培養基沖洗凝膠及小室；③ 將小室放入盛有800 μL 10%FBS培養液的24孔板，于37℃、5%CO2及飽和濕度孵育箱里培養；④ 每隔24 h觀察凝膠中細胞的遷移情況，標記顯微鏡初始焦距，從上至下調整焦距，間隔1～2 mm，將每個凝膠分為4層（第1～4層）。各層于0、24、48 h隨機取5個視野，于400倍顯微鏡下觀察細胞并計數。
1.4 動物實驗
1.4.1 全層皮膚缺損小鼠模型制備及分組
按照1.3.1方法制作hUCMSCs-海藻酸鈣凝膠復合物，加入10%FBS培養液2 mL；另將海藻酸鈉溶液與CaCl2溶液按1∶1體積比混合成膠后，分別與細胞上清液、10%FBS培養液及0.01 mol/L PBS緩沖液2 mL共培養。取Balb/c雄性小鼠32只，腹腔注射10%水合氯醛（0.005 mL/g）麻醉，背部皮膚脫毛，用眼科剪制作深達皮膚全層及肌筋膜、直徑1.2～1.5 cm的圓形皮膚缺損（圖 1 a），以內徑為2 cm的硬質塑料環固定創面（圖 1 b）。根據創面修復方法不同，將小鼠模型隨機分為4組，每組8只。創面分別以hUCMSCs-海藻酸鈣凝膠復合物（MSC-凝膠組）、細胞上清液-海藻酸鈣凝膠復合物（CS-凝膠組）、10%FBS-海藻酸鈣凝膠復合物（FBS-凝膠組）及0.01 mol/ L PBS-海藻酸鈣凝膠復合物（PBS-凝膠組）覆蓋（圖 1 c）。凝膠外均以透明靜脈輸液固定護貼遮蓋固定（圖 1 d）。小鼠于相同條件下單籠飼養，凝膠敷料于術后第3天更換1次。
圖1
小鼠全層皮膚缺損模型制備及修復 ? 背部圓形皮膚缺損 ? 硬質塑料環固定創面 ? hUCMSCs-海藻酸鈣凝膠復合物覆蓋創面 ? 靜脈輸液固定護貼遮蓋固定 ? ?1.4.2 觀測指標
① 創面愈合率測量：觀察記錄各組動物創面愈合情況，于第5、10、15天用Image J軟件測量創面面積，并按照以下公式計算創面愈合率： （初始創面面積－測量日創面面積）/初始創面面積 ×100%。 ② 組織學觀察：術后第15天斷頸處死全部小鼠，完整切取創面皮膚標本，常規行石蠟切片，片厚5 μm。取部分切片行HE染色，鏡下觀察新生皮膚結構特征。③ 免疫組織化學染色：另取石蠟切片行免疫組織化學染色，檢測皮膚VEGF表達情況。具體步驟：切片脫蠟、水化，滅活內源性酶，抗原熱修復，封閉液封片，滴加兔抗小鼠VEGF單克隆抗體（一抗）；洗滌切片，滴加山羊抗兔IgG單克隆抗體（二抗）；DAB顯色，蘇木精復染，脫水、封片后于鏡下觀察、拍照。取剩余石蠟切片采用CD31免疫組織化學試劑盒同上法檢測CD31標記血管內皮細胞。以細胞呈棕色染色作為陽性表達，于200倍鏡下于對應染色切片隨機取5個視野觀察CD31陽性表達細胞，行毛細血管計數；取5個視野用Image J軟件計數VEGF陽性表達細胞。
1.5 統計學方法
采用SPSLS.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni事后檢驗；檢驗水準α= 0.05。
2 結果
2.1 hUCMSCs與凝膠支架共培養觀察
2.1.1 凝膠支架中細胞生長特征
倒置相差顯微鏡下觀察示，細胞種植于凝膠支架3 h后，可見細胞呈單個圓形或橢圓形，表面不規則（圖 2 a）；第3天細胞呈克隆樣生長，每簇由數個細胞（2～7個）組成（圖 2 b）；第6天和第9天可見細胞呈葡萄樣生長，細胞間聯系緊密（圖 2 c、d）。對照組細胞培養3 h后開始貼壁，呈扁橢圓形（圖 3 a）；第3天細胞呈長梭形生長，平鋪于板底（圖 3 b）；第6天細胞已達100%融合（圖 3 c）；第9天細胞大量死亡或變形（圖 3 d）。
2.1.2 VEGF檢測與細胞計數
ELISA檢測示：實驗組及對照組上清液中VEGF含量分別于第6天及第3天達峰值，各組組內各時間點間比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。培養第3天實驗組VEGF表達量明顯低于對照組（P＜0.05）；之后實驗組表達量逐漸增加，第6、9天時明顯高于對照組，比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖 4。
流式細胞計數顯示：兩組細胞數量均于第6天達峰值；兩組第6、9天細胞均顯著多于第3天，差異有統計學意義（P＜0.05）；第9天時對照組細胞較第6天明顯減少（P＜0.05），而實驗組細胞與第6天比較差異無統計學意義（P＞0.05）。培養第3天實驗組細胞明顯少于對照組（P＜0.05），第6天兩組差異無統計學意義（P＞0.05），而第9天實驗組細胞明顯多于對照組（P＜0.05）。見圖 5。
2.1.3 細胞遷移能力檢測
培養0 h時，各層細胞數量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。隨培養時間延長，細胞由凝膠上層（第1、2層）逐漸向下層（第3、4層）遷移，24、48 h時各層細胞數量存在顯著差異，凝膠下層的細胞數量明顯多于凝膠上層，比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖 6。經過7 d觀察未見細胞穿過整個凝膠遷移至小室底膜。
圖6
兩組各時間點細胞遷移計數 ? ?2.2 動物實驗觀察
2.2.1 創面愈合率測量
各組動物均存活至實驗完成。其中FBS-凝膠組中2只小鼠創面發生感染，未經特殊處理，自行好轉。隨時間延長，各組創面均逐漸愈合，組內各時間點間創面愈合率比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。其中MSC-凝膠組及CS-凝膠組創面愈合良好，第5、10、15天創面愈合率顯著高于FBS-凝膠組及PBS-凝膠組，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；而前兩組間及后兩組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖 7及表 1。
表1
各組術后各時間點創面愈合率比較（n=8，%，2.2.2 組織學觀察
鏡下觀察示，MSC-凝膠組與CS-凝膠組創面皮膚的鱗狀上皮、成纖維細胞、皮脂腺及毛細血管均較FBS-凝膠組及PBS-凝膠組多，且排列較整齊，表皮層與其下的纖維結締組織結合較緊密（圖 8）。
2.2.3 免疫組織化學染色觀察
鏡下可見各組VEGF廣泛表達于真皮層細胞及細胞外基質中，尤其多見于新生血管的內皮細胞（圖 9）。其中，MSCs-凝膠組和CS-凝膠組的VEGF陽性表達細胞分別為（144.60±18.84）個及（152.80±14.13）個，明顯高于FBS-凝膠組及PBS-凝膠組的（61.60±14.54）個及（56.40± 6.88）個，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；而前兩組間及后兩組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。MSCs-凝膠組和CS-凝膠組的毛細血管數分別為（20.60±4.51）個及（19.20±3.90）個，明顯高于FBS-凝膠組及PBS-凝膠組的（8.00±1.58）個及（9.80± 3.42） 個，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；而前兩組間及后兩組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。
3 討論
傷口愈合涉及到一系列相互重疊和相互關聯的階段性病理變化，在愈合過程中，許多細胞和基質成分共同參與了受傷組織的更換和缺損組織的重建[14]。現代重建醫學與組織工程的基本策略是：從活體組織分離細胞，在體外擴增后將其種植于特制的三維支架材料，再以細胞或細胞支架復合物修復損傷組織[15]。
海藻酸鈣凝膠對組織細胞無毒性，且具有一定的可生物降解性[16-17]，因而被廣泛應用于細胞培養。據報道，由濃度為100～150 mmol/L的海藻酸鈉所制得的海藻酸鈣凝膠多孔支架最適合細胞黏附、增殖及表達ECM，且該濃度范圍的凝膠孔徑較均勻（50～200 μm），機械強度較好[18]。本研究將hUC MSCs種植于由150 mmol/L海藻酸鈉制備的凝膠支架中，細胞生長良好，在無消化傳代條件下可生長增殖達1周以上。在凝膠系統中，細胞呈葡萄樣生長，該生長方式與傳統培養（呈長梭形）明顯不同。通過細胞計數，發現實驗組細胞數量于第3天后迅速上升，于第6天與對照組一致并共同達到高峰，第6天后對照組細胞逐漸死亡，而實驗組細胞仍維持其生長狀態。以上結果表明，hUCMSCs在海藻酸鈣凝膠支架中保持了活性，甚至能在立體環境中較長時間地生長、增殖。
創傷是外科常見病，組織工程中常用干細胞治療損傷嚴重或面積較大的急、慢性創傷。干細胞療法的作用機制主要有兩種理論：一種是細胞替代理論[19]，即干細胞通過定向分化方式，從結構及功能上替代宿主的缺損細胞或組織；另一種是旁分泌理論[13]，即干細胞通過分泌某些細胞因子激活特定的信號通路，從而促使缺損組織的修復與重建。然而，其具體作用機制尚存在爭議，目前國外研究結論更偏向于后一種，并認為在眾多細胞因子中以VEGF尤為重要。本研究細胞計數及VEGF檢測結果顯示，第3天實驗組細胞數量及VEGF表達量均明顯低于對照組。其原因可能為hUCMSCs種植于海藻酸鈣凝膠支架后的前3天，細胞處于適應階段，生長較緩慢，故實驗組VEGF表達量相對較低；另外，在收集細胞上清液時，因部分VEGF停留在凝膠支架中未被檢測到，以致實驗組的VEGF表達量相對較少。隨著培養時間增加，第6天和第9天實驗組細胞VEGF表達量明顯高于對照組。表明細胞在海藻酸鈣凝膠中更適合長時間地生長增殖，并發揮其功 能。
細胞遷移實驗觀察見，hUCMSCs在海藻酸鈣凝膠支架中雖具有一定的遷移能力，但尚不能從凝膠支架中遷移出。表明海藻酸鈣凝膠支架雖能為細胞的生長增殖提供合適的孔徑或空間，卻沒有足夠大的通道允許細胞自由遷移。然而，細胞可在凝膠支架中良好地生長，說明該支架具有較好的通透性，液體中的氧氣及細胞因子等營養成分能自由通過凝膠系統[20]。
進一步動物實驗表明，hUCMSCs及其上清液與海藻酸鈣凝膠形成的復合物可顯著促進小鼠創面愈合，且該兩組愈合情況無明顯差異，我們認為這可能與hUCMSCs是通過分泌某些細胞因子促進了創面修復有關。溫暖、濕潤的微環境有利于傷口愈合[2]，本研究將細胞-海藻酸鈣凝膠復合物置于動物皮膚缺損處，該復合物不但具有傷口防護作用，還可以保持傷口局部濕潤。同時，在創傷初期，傷口周圍的滲出液或血液對凝膠中的hUCMSCs是一種良好的培養基，從而可通過旁分泌機制[13, 21]對創傷組織進行持續地修復重建，促進傷口快速愈合。
綜上述，hUCMSCs能在海藻酸鈣凝膠中較長時間地分裂增殖，并較持久地分泌表達傷口愈合所必需的生長因子VEGF，為hUCMSCs-海藻酸鹽敷料的臨床應用提供了理論依據。
