引用本文： 南偉, 張海鴻, 伍亞民. 神經調控血管生成機制的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(12): 1570-1573. doi: 10.7507/1002-1892.20150334 復制
血管生成包括血管發生、血管新生和動脈形成[1]。血管發生指機體通過動員循環中的血管內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs），促使其聚集于受損部位，并分化為成熟的血管內皮細胞形成血管的過程。血管新生指機體固有血管中的成熟內皮細胞增殖、遷移，以出芽和有絲分裂方式形成新毛細血管的過程，主要涉及以下環節：① 血管擴張，細胞間隙增大，血管壁通透性增高；② 基底膜溶解；③ 內皮細胞分裂增殖、趨化、遷移；④ 形成新的管腔。動脈形成則體現了內皮細胞和血管平滑肌細胞間的相互作用，包括上述兩種細胞的增殖、遷移、分化及血管重塑等過程。
血管系統和神經系統的功能截然不同，但在哺乳動物體內血管和神經相伴而行，走行路徑保持較高一致性。中樞神經系統中，血管和神經組織及細胞間以特定的三維空間相互聯系，通過多種細胞因子間的復雜作用互相影響生物學行為；周圍神經系統中，全身各器官和大多數組織的血管及神經也是相伴而行。
神經系統分泌的一些信號分子不僅能促進神經細胞生長和軸突延伸，對血管網絡的形成及走行也發揮重要作用[2]。但其相關機制復雜，涉及基因、分子、細胞、組織等方面，目前尚未明確。本文就目前血管生成的神經調控機制研究現狀及進展進行綜述，為臨床有效治療神經血管疾病提供思路。
1 神經和血管的相互聯系
血管生成和神經生長關系密切，研究表明神經生長常發生于血管生成之后[3-4]，損傷后的神經組織往往沿血管路徑生長，與此同時大量EPCs發生增殖遷移，分化為成熟血管內皮細胞進而形成微血管。血管為神經生長提供了良好的微環境，而且血管內皮細胞對神經細胞具有保護作用。神經血管單元（neurovascular unit，NVU）概念的提出充分體現了血管、神經之間的密切關系，NVU由微血管、神經元及 其軸突和血管周圍星形膠質細胞組成，其中神經 細胞和內皮細胞之間相互偶聯，通過細胞-細胞間信號、串話等機制，共同參與神經血管重塑，調節神經遞質達到動態平衡，維護血-腦、血-脊髓屏障穩定。
有關小鼠腦和視網膜血管生成模型的研究發現[5]，尖端細胞通過伸出偽足來感應周圍環境中引起血管生成的刺激，從而引導芽體延伸的方向和目的。其中細胞間的相互聯系及其作用的相互轉化可能源于尖端細胞和柄細胞的不穩定性[6]，相關信號之間的相互作用在這一過程中發揮重要作用。提示神經等其他因素對血管生成過程具有重要的調控作 用。
2 神經調控血管生成的細胞機制
2.1 神經干細胞（neural stem cells，NSCs）
NSCs能分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞等，是具有自我更新能力的細胞群。自Reynolds等[7]從成年小鼠腦紋狀體中分離獲得 NSCs后，NSCs已成為神經學科領域研究的熱點。脊髓損傷后由于細胞賴以生存的微環境被嚴重破壞，NSCs絕大部分分化為星形膠質細胞形成瘢痕，影響神經功能恢復，分化為神經元較少，而且損傷區血管生成速度明顯降低，提示神經調控在血管生成中具有不可替代的作用。據此推測通過改善損傷區的微環境使其有利于神經組織的生長，重建神經通路，加快功能恢復，可能能夠引導損傷區血管生成，增加血供，達到修復脊髓損傷的目的。
Inoue等[8]將含有NSCs的人乳牙牙髓干細胞培養液（stem cells from human exfoliated decidous-culture medium，SHED-CM）注入中腦動脈栓塞的雄性SD大鼠鼻內，在梗死周圍區域SHED-CM組比DMEM組表達更多的大鼠內皮細胞抗原和神經元，而且觀察到NSCs和來自于腦室下區的樹突狀細胞向梗死周圍遷移，與梗死區域的血管生成關系密切。其他類似研究也發現，在缺血后期毛細血管新生部位與神經分布及走行具有一定相關性[9]。上述研究結果提示，在神經血管損傷病變中，神經細胞及其分泌的細胞因子在促進有功能的微血管形成中起重要作用。
2.2 EPCs
1997年，Asahara等[10]首次報道了血管內皮細胞的前體細胞--EPCs，之后EPCs成為血管學科及神經血管交叉學科領域研究熱點。無論胚胎階段的血管發生，還是出生后的血管生成，EPCs都發揮著重要作用。EPCs不僅能通過分化為成熟的內皮細胞直接參與血管新生進程，還能分泌大量的細胞因子促進內皮細胞的增殖、存活，進而促進血管生成[11]。其中，基質金屬蛋白酶 （matrix-metalloproteinases，MMPs）、尿激酶型纖溶酶原激活因子、中性粒細胞彈性蛋白酶及組織蛋白酶等在EPCs的血管生成過程中發揮重要作用。另外，EPCs 及血管內皮細胞分泌的腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、VEGF、IGF、色素上皮衍生因子等多種細胞因子[12]均被證實具有不同程度神經營養作用，在促進神經生長、重建修復神經功能中發揮重要作用。
干細胞因子（stem cell factor，SCF）的受體CD 117（SCF/CD117）是一種跨膜絡氨酸激酶，僅表達于人內皮細胞、正常造血干/祖細胞及早期髓系細胞。SCF/CD117通過促進EPCs的增殖、遷移及分化在早期血管形成過程中起重要作用[13]。血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）是一種由血管內皮細胞和巨核細胞合成、分泌的糖蛋白，存在于內皮細胞表面，另外在血漿和血小板中也有表達[14]。vWF可作為判斷血管生成能力的指標，其通過二硫鍵相連成二聚體和多聚體形式存在于體內，體外可與內皮細胞、肝素以及平滑肌細胞基質結合。He等[15]將牙髓干細胞和EPCs共植于雞胚絨毛尿囊膜（chorioallantoic membrane，CAM）構建三維培養體系，光鏡下觀察到白色致密團塊，共聚焦顯微鏡下借助熒光標記明確了EPCs在CAM中的分布區域，說明EPCs可與其他不同類型的細胞共存于干細胞聚合物中。Kim等[16]將EPCs和牙髓干細胞共培養，通過細胞之間的相互作用及其形成的微環境體系，持續進行血管化。近年來對不同種類細胞聯合培養的研究發現，共培養體系各類細胞可通過細胞因子等活性物質的胞間轉移及其相應的信號傳導通路精細調控細胞的功能[17-18]。提示可以通過不同種類種子細胞的共培養模擬體內微環境，促進共培養體系中EPCs 的內皮化，從而提升血管形成能力。借鑒以上研究思路和方法，將EPCs和NSCs聯合培養構建神經調控的血管化移植材料移植于支架載體，是治療神經血管損傷性疾病的新思路。
3 神經調控血管生成的分子機制
神經調控血管生成過程有賴于NVU中不同種類細胞間相互協同作用，同時還與神經再生、突觸重塑等多種修復機制關系密切，除此之外多種細胞因子的共同參與也發揮著重要作用。
3.1 VEGF
VEGF通過促進細胞移行、增加血管內皮通透性、促進間質細胞分泌成熟血管基質及修復受損內膜等途徑參與血管生成[19]。VEGF除表達于血管內皮細胞外，也見于正常腦組織的脈絡叢星形膠質細胞、海馬齒狀回及嗅球球周層神經元等 [20]。其家族主要包括6類細胞因子，其中信號蛋白VEGF-A及其受體VEGFR2在血管生成過程中發揮重要作用，VEGFR2與配體VEGF-A結合后不僅能促進細胞的增殖分裂，刺激EPCs的遷移，還能提高EPCs對化學趨向性的應答[21]。VEGF-A/VEGFR2與Delta/Notch信號通路共同介導了EPCs向內皮尖端細胞和柄細胞的分化[22]，內皮尖端細胞在血管出芽中發揮重要作用，柄細胞則促進了血管腔樣結構的形成。而內皮尖端細胞對神經誘導因子反應同樣敏感[23]，因此神經細胞分泌的VEGF及神經誘導因子可能通過上述信號通路參與調節血管生成。另外，Saleh等[24]的研究顯示，外周血VEGF水平與血管生成相關基因NOS3、CD14、MMP-3、 IL-4R、IL-4等關系密切。
3.2 BDNF
BDNF在神經生長和突觸重塑中的重要作用已得到廣泛認同，另外在整個圍血管生成期BDNF對骨骼肌和大動脈等器官組織同樣具有重要作用。研究顯示，導向分子家族Netrins不僅能促進軸突生長，而且在血管生長發育過程中扮演著更為重要的角色[25]。其中，Netrin-1 除了誘導神經軸突的生長外，還能刺激EPCs增殖、遷移，促進血管生成，并且對血管內皮細胞有一定保護作用[26]。上述研究提示，神經纖維通過軸漿將BDNF和Netrin-1等活性神經營養因子運輸達血管生成部位，在促進神經結構功能恢復的同時促進EPCs歸巢于血管受損部，維持其干系，誘導旁分泌，提供良好的局部微環境促進血管生 成。
3.3 FGF
FGF是一種非特異性促進血管生成的作用因子，作用于血管內皮細胞時，可促進細胞增殖分裂、遷移和形成管腔，正向調控血管生成。對多種動物缺血模型研究顯示，注射FGF后能夠促進梗死周圍區域血管內皮細胞增殖[27]，提高新生血管數目，縮小梗死面積，抑制 Caspase-3的激活，改善動物行為學評分，促進神經功能恢復。
3.4 高遷移率族蛋白1（high mobility group box-1 protein，HMGB1）
HMGB1是一種核蛋白，神經元、膠質細胞通過釋放HMGB1，參與缺血損傷后NVU的修復。在腦缺血急性期，HMGB1介導急性炎性反應，引起腦組織損傷；在腦缺血恢復期，參與血管生成和神經再生等修復過程。在TLR4-/-小鼠和野生型小鼠誘導血管生成的實驗中發現，前者堿燒傷角膜處的新生血管減少，但兩者損傷角膜處 HMGB1均高表達，提示HMGB1-TLR4信號通路和血管生成有關[28]。
3.5 血管生成素（angiogenin，Ang）
Ang家族包括 Ang-1、2 等因子。對運動康復治療改善中腦動脈栓塞大鼠模型神經功能的研究發現，血管生成與Ang-1/Tie-2 信號通路的激活有關[29]。Ang-2通過拮抗 Ang-1抑制血管生成，是 Ang-1 的競爭性抑制物。有研究對中腦動脈栓塞大鼠模型側腦室注入攜帶Ang-1和VEGF基因的重組載體，觀察發現受損區新生血管增多，血-腦屏障功能改善，梗死面積明顯減小[30]。提示在機體缺血損傷后血管生成的修復過程中，VEGF/VEGFR和Ang-1/Tie-2信號通路可能具有協同和互補作用。
4 問題與展望
近年來，神經和血管學科的交叉研究，完善了對缺血性疾病的認識，為該領域的研究引入了新的理念、思維，探索了新的途徑。但是對神經調控下血管生成的信號傳導途徑和基因信號通路等方面的具體調控機制尚不清楚，大多數研究僅限于細胞實驗或動物實驗，轉化為臨床應用仍有較大的差距。對神經調控下血管生成可能機制的進一步研究，將有助于深化對血管損傷后再生修復過程的認識。就目前研究現狀而言，仍有很多問題亟待解決：① 是否可以通過將NSCs與EPCs構建共移植體，使血管生成和神經再生有機結合起來，協調神經營養因子及血管生長因子等多種細胞因子在血管生成和神經再生中的作用，在修復損傷神經組織結構同時，通過神經調控促進移植區血管生成。② 病理狀態下，NVU各組分之間的信號聯系改變，在諸多靶點中如 何 選 擇 并 進行有效干預，改善NVU內部的穩態和保證細胞功能的正常運行。③ 在臨床應用中如何篩選對EPCs增殖分化更有效的神經調控因子，制備相應藥物促進該類因子的表達，充分協調血管和神經的相互作用，從而促進干細胞的增殖與分化以達到治療目的。
血管生成包括血管發生、血管新生和動脈形成[1]。血管發生指機體通過動員循環中的血管內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs），促使其聚集于受損部位，并分化為成熟的血管內皮細胞形成血管的過程。血管新生指機體固有血管中的成熟內皮細胞增殖、遷移，以出芽和有絲分裂方式形成新毛細血管的過程，主要涉及以下環節：① 血管擴張，細胞間隙增大，血管壁通透性增高；② 基底膜溶解；③ 內皮細胞分裂增殖、趨化、遷移；④ 形成新的管腔。動脈形成則體現了內皮細胞和血管平滑肌細胞間的相互作用，包括上述兩種細胞的增殖、遷移、分化及血管重塑等過程。
血管系統和神經系統的功能截然不同，但在哺乳動物體內血管和神經相伴而行，走行路徑保持較高一致性。中樞神經系統中，血管和神經組織及細胞間以特定的三維空間相互聯系，通過多種細胞因子間的復雜作用互相影響生物學行為；周圍神經系統中，全身各器官和大多數組織的血管及神經也是相伴而行。
神經系統分泌的一些信號分子不僅能促進神經細胞生長和軸突延伸，對血管網絡的形成及走行也發揮重要作用[2]。但其相關機制復雜，涉及基因、分子、細胞、組織等方面，目前尚未明確。本文就目前血管生成的神經調控機制研究現狀及進展進行綜述，為臨床有效治療神經血管疾病提供思路。
1 神經和血管的相互聯系
血管生成和神經生長關系密切，研究表明神經生長常發生于血管生成之后[3-4]，損傷后的神經組織往往沿血管路徑生長，與此同時大量EPCs發生增殖遷移，分化為成熟血管內皮細胞進而形成微血管。血管為神經生長提供了良好的微環境，而且血管內皮細胞對神經細胞具有保護作用。神經血管單元（neurovascular unit，NVU）概念的提出充分體現了血管、神經之間的密切關系，NVU由微血管、神經元及 其軸突和血管周圍星形膠質細胞組成，其中神經 細胞和內皮細胞之間相互偶聯，通過細胞-細胞間信號、串話等機制，共同參與神經血管重塑，調節神經遞質達到動態平衡，維護血-腦、血-脊髓屏障穩定。
有關小鼠腦和視網膜血管生成模型的研究發現[5]，尖端細胞通過伸出偽足來感應周圍環境中引起血管生成的刺激，從而引導芽體延伸的方向和目的。其中細胞間的相互聯系及其作用的相互轉化可能源于尖端細胞和柄細胞的不穩定性[6]，相關信號之間的相互作用在這一過程中發揮重要作用。提示神經等其他因素對血管生成過程具有重要的調控作 用。
2 神經調控血管生成的細胞機制
2.1 神經干細胞（neural stem cells，NSCs）
NSCs能分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞等，是具有自我更新能力的細胞群。自Reynolds等[7]從成年小鼠腦紋狀體中分離獲得 NSCs后，NSCs已成為神經學科領域研究的熱點。脊髓損傷后由于細胞賴以生存的微環境被嚴重破壞，NSCs絕大部分分化為星形膠質細胞形成瘢痕，影響神經功能恢復，分化為神經元較少，而且損傷區血管生成速度明顯降低，提示神經調控在血管生成中具有不可替代的作用。據此推測通過改善損傷區的微環境使其有利于神經組織的生長，重建神經通路，加快功能恢復，可能能夠引導損傷區血管生成，增加血供，達到修復脊髓損傷的目的。
Inoue等[8]將含有NSCs的人乳牙牙髓干細胞培養液（stem cells from human exfoliated decidous-culture medium，SHED-CM）注入中腦動脈栓塞的雄性SD大鼠鼻內，在梗死周圍區域SHED-CM組比DMEM組表達更多的大鼠內皮細胞抗原和神經元，而且觀察到NSCs和來自于腦室下區的樹突狀細胞向梗死周圍遷移，與梗死區域的血管生成關系密切。其他類似研究也發現，在缺血后期毛細血管新生部位與神經分布及走行具有一定相關性[9]。上述研究結果提示，在神經血管損傷病變中，神經細胞及其分泌的細胞因子在促進有功能的微血管形成中起重要作用。
2.2 EPCs
1997年，Asahara等[10]首次報道了血管內皮細胞的前體細胞--EPCs，之后EPCs成為血管學科及神經血管交叉學科領域研究熱點。無論胚胎階段的血管發生，還是出生后的血管生成，EPCs都發揮著重要作用。EPCs不僅能通過分化為成熟的內皮細胞直接參與血管新生進程，還能分泌大量的細胞因子促進內皮細胞的增殖、存活，進而促進血管生成[11]。其中，基質金屬蛋白酶 （matrix-metalloproteinases，MMPs）、尿激酶型纖溶酶原激活因子、中性粒細胞彈性蛋白酶及組織蛋白酶等在EPCs的血管生成過程中發揮重要作用。另外，EPCs 及血管內皮細胞分泌的腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、VEGF、IGF、色素上皮衍生因子等多種細胞因子[12]均被證實具有不同程度神經營養作用，在促進神經生長、重建修復神經功能中發揮重要作用。
干細胞因子（stem cell factor，SCF）的受體CD 117（SCF/CD117）是一種跨膜絡氨酸激酶，僅表達于人內皮細胞、正常造血干/祖細胞及早期髓系細胞。SCF/CD117通過促進EPCs的增殖、遷移及分化在早期血管形成過程中起重要作用[13]。血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）是一種由血管內皮細胞和巨核細胞合成、分泌的糖蛋白，存在于內皮細胞表面，另外在血漿和血小板中也有表達[14]。vWF可作為判斷血管生成能力的指標，其通過二硫鍵相連成二聚體和多聚體形式存在于體內，體外可與內皮細胞、肝素以及平滑肌細胞基質結合。He等[15]將牙髓干細胞和EPCs共植于雞胚絨毛尿囊膜（chorioallantoic membrane，CAM）構建三維培養體系，光鏡下觀察到白色致密團塊，共聚焦顯微鏡下借助熒光標記明確了EPCs在CAM中的分布區域，說明EPCs可與其他不同類型的細胞共存于干細胞聚合物中。Kim等[16]將EPCs和牙髓干細胞共培養，通過細胞之間的相互作用及其形成的微環境體系，持續進行血管化。近年來對不同種類細胞聯合培養的研究發現，共培養體系各類細胞可通過細胞因子等活性物質的胞間轉移及其相應的信號傳導通路精細調控細胞的功能[17-18]。提示可以通過不同種類種子細胞的共培養模擬體內微環境，促進共培養體系中EPCs 的內皮化，從而提升血管形成能力。借鑒以上研究思路和方法，將EPCs和NSCs聯合培養構建神經調控的血管化移植材料移植于支架載體，是治療神經血管損傷性疾病的新思路。
3 神經調控血管生成的分子機制
神經調控血管生成過程有賴于NVU中不同種類細胞間相互協同作用，同時還與神經再生、突觸重塑等多種修復機制關系密切，除此之外多種細胞因子的共同參與也發揮著重要作用。
3.1 VEGF
VEGF通過促進細胞移行、增加血管內皮通透性、促進間質細胞分泌成熟血管基質及修復受損內膜等途徑參與血管生成[19]。VEGF除表達于血管內皮細胞外，也見于正常腦組織的脈絡叢星形膠質細胞、海馬齒狀回及嗅球球周層神經元等 [20]。其家族主要包括6類細胞因子，其中信號蛋白VEGF-A及其受體VEGFR2在血管生成過程中發揮重要作用，VEGFR2與配體VEGF-A結合后不僅能促進細胞的增殖分裂，刺激EPCs的遷移，還能提高EPCs對化學趨向性的應答[21]。VEGF-A/VEGFR2與Delta/Notch信號通路共同介導了EPCs向內皮尖端細胞和柄細胞的分化[22]，內皮尖端細胞在血管出芽中發揮重要作用，柄細胞則促進了血管腔樣結構的形成。而內皮尖端細胞對神經誘導因子反應同樣敏感[23]，因此神經細胞分泌的VEGF及神經誘導因子可能通過上述信號通路參與調節血管生成。另外，Saleh等[24]的研究顯示，外周血VEGF水平與血管生成相關基因NOS3、CD14、MMP-3、 IL-4R、IL-4等關系密切。
3.2 BDNF
BDNF在神經生長和突觸重塑中的重要作用已得到廣泛認同，另外在整個圍血管生成期BDNF對骨骼肌和大動脈等器官組織同樣具有重要作用。研究顯示，導向分子家族Netrins不僅能促進軸突生長，而且在血管生長發育過程中扮演著更為重要的角色[25]。其中，Netrin-1 除了誘導神經軸突的生長外，還能刺激EPCs增殖、遷移，促進血管生成，并且對血管內皮細胞有一定保護作用[26]。上述研究提示，神經纖維通過軸漿將BDNF和Netrin-1等活性神經營養因子運輸達血管生成部位，在促進神經結構功能恢復的同時促進EPCs歸巢于血管受損部，維持其干系，誘導旁分泌，提供良好的局部微環境促進血管生 成。
3.3 FGF
FGF是一種非特異性促進血管生成的作用因子，作用于血管內皮細胞時，可促進細胞增殖分裂、遷移和形成管腔，正向調控血管生成。對多種動物缺血模型研究顯示，注射FGF后能夠促進梗死周圍區域血管內皮細胞增殖[27]，提高新生血管數目，縮小梗死面積，抑制 Caspase-3的激活，改善動物行為學評分，促進神經功能恢復。
3.4 高遷移率族蛋白1（high mobility group box-1 protein，HMGB1）
HMGB1是一種核蛋白，神經元、膠質細胞通過釋放HMGB1，參與缺血損傷后NVU的修復。在腦缺血急性期，HMGB1介導急性炎性反應，引起腦組織損傷；在腦缺血恢復期，參與血管生成和神經再生等修復過程。在TLR4-/-小鼠和野生型小鼠誘導血管生成的實驗中發現，前者堿燒傷角膜處的新生血管減少，但兩者損傷角膜處 HMGB1均高表達，提示HMGB1-TLR4信號通路和血管生成有關[28]。
3.5 血管生成素（angiogenin，Ang）
Ang家族包括 Ang-1、2 等因子。對運動康復治療改善中腦動脈栓塞大鼠模型神經功能的研究發現，血管生成與Ang-1/Tie-2 信號通路的激活有關[29]。Ang-2通過拮抗 Ang-1抑制血管生成，是 Ang-1 的競爭性抑制物。有研究對中腦動脈栓塞大鼠模型側腦室注入攜帶Ang-1和VEGF基因的重組載體，觀察發現受損區新生血管增多，血-腦屏障功能改善，梗死面積明顯減小[30]。提示在機體缺血損傷后血管生成的修復過程中，VEGF/VEGFR和Ang-1/Tie-2信號通路可能具有協同和互補作用。
4 問題與展望
近年來，神經和血管學科的交叉研究，完善了對缺血性疾病的認識，為該領域的研究引入了新的理念、思維，探索了新的途徑。但是對神經調控下血管生成的信號傳導途徑和基因信號通路等方面的具體調控機制尚不清楚，大多數研究僅限于細胞實驗或動物實驗，轉化為臨床應用仍有較大的差距。對神經調控下血管生成可能機制的進一步研究，將有助于深化對血管損傷后再生修復過程的認識。就目前研究現狀而言，仍有很多問題亟待解決：① 是否可以通過將NSCs與EPCs構建共移植體，使血管生成和神經再生有機結合起來，協調神經營養因子及血管生長因子等多種細胞因子在血管生成和神經再生中的作用，在修復損傷神經組織結構同時，通過神經調控促進移植區血管生成。② 病理狀態下，NVU各組分之間的信號聯系改變，在諸多靶點中如 何 選 擇 并 進行有效干預，改善NVU內部的穩態和保證細胞功能的正常運行。③ 在臨床應用中如何篩選對EPCs增殖分化更有效的神經調控因子，制備相應藥物促進該類因子的表達，充分協調血管和神經的相互作用，從而促進干細胞的增殖與分化以達到治療目的。