引用本文： 朱海濤, 張小鴿, 賀雅毅, 于良, 呂毅, 潘凱麗, 王博, 陳國強. 胰島移植治療糖尿病的細胞來源研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(1): 104-111. doi: 10.7507/1002-1892.201707049 復制
1 型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）是一種全球流行性的慢性自身免疫疾病，對人類健康危害極大[1-3]。外源性胰島素輸注是目前臨床治療 T1DM 的標準療法，但其仍達不到理想的血糖控制，低血糖的發生和微血管病變進展的風險仍然存在。旨在重建內源性胰島素分泌系統的 β 細胞替代治療，因具有維持葡萄糖自穩態的優勢，而逐漸成為關注與研究的熱點[4-7]。目前，臨床可用的 β 細胞替代治療為胰腺移植（pancreas transplantation，PT）和胰島移植（pancreatic islet transplantation，PIT）[8-10]。自 2000 年加拿大 Edmontion 方案取得成功后[11]，隨著免疫調節與細胞制備等技術的改進，PIT 后的血糖控制與長期（3 年、5 年）脫離胰島素的比例現已基本接近 PT[12-16]。與 PT 相比，PIT 具有手術風險低、操作簡便、可體外修飾移植物及多次輸注等優點，是一種極具前景的糖尿病治療方法[5, 13, 15, 17-18]。然而，和器官移植一樣，PIT 面臨的首要挑戰是供體的缺乏[19]，提供充足、合適的供胰來源，是臨床廣泛開展 PIT 治療 T1DM 的前提。現就 PIT 的供體細胞來源作一綜述。
1 同種（人類）來源胰島細胞
1.1 同種異體來源胰島細胞
來自國際協同胰島移植登記處（CITR）2014 年末的統計報告顯示，腦死亡捐贈（donation after brain death，DBD）供胰（同種異體）目前仍是臨床 PIT 的主要供體來源。近年來，心臟死亡捐贈（donation after cardiac death，DCD）供胰逐漸成為另一有效替代細胞來源。與 DBD 相比，DCD 器官通常會遭受更為嚴重的缺血再灌注損傷。DCD 供胰存在外分泌細胞缺血損傷致胰腺炎的風險，不適用于 PT，潛在擴大了供體胰島來源。活體供胰 PIT 曾由日本京都大學于 2005 年首次報道[20-21]，1 例 27 歲女性 T1DM 患者接受了其母親遠端胰腺來源的胰島細胞，術后短期及 1 年隨訪顯示，供、受體均維持著良好的血糖控制狀態。雖然活體供胰具有緩解供體缺乏、胰島活性高（缺血損傷小）等優勢；但供體面臨手術干預，且存在手術致糖尿病及外科并發癥等風險，目前較少應用。
多項研究表明[5, 11, 14]，輸注至少 60 萬胰島當量（islet equivalents，IEQs）的移植物（平均 10 000 IEQs/kg），可使 75% ~ 80% 受者達到理想的胰島素水平。成年人胰腺中大約含有 100 萬個胰島，目前分離純化條件下僅有不足 50% 的胰島細胞可獲取[11, 14, 22]，故一般需要 2 ~ 4 個供胰以滿足 1 個受體的移植需求。以美國為例，每年大約有 8 000 名器官捐贈者，僅有不到 30% 的胰腺器官被用于移植[23-24]。因此，供胰數量遠不能達到 T1DM 患者的需求。此外，多供體來源的 PIT 也會增加受體對人類白細胞抗原致敏的風險幾率。雖然已有成功進行臨床“一對一”PIT 的報道[25-26]，但從多供體全面地過渡到單供體移植階段，仍需要在諸多方面取得進展，比如合適供胰的選擇，冷、熱缺血及消化分離過程中胰島的保護，穩定、高效、低毒的消化酶應用，優化的標準化制備流程，簡便、可靠的移植物效能測評，強效的免疫誘導及促移植物定植策略等[12, 25-27]。Al-Adra 等[26]近年研究表明，受者術前每日胰島素用量<0.6 U/kg 與移植細胞數量>5 646 IEQs/kg，是預測單供體 PIT 后獲得脫離胰島素的兩個獨立影響因素。
為篩選出最佳的胰島供體、減少捐獻者的個體差異對細胞分離結果的影響，O’Gorman 等于 2005 年首次建立起胰島供體評分系統[28-29]。該評分系統對多個供體特征變量進行了評估分析，如年齡、冷缺血時間、體質量指數（body mass index，BMI）、死亡原因、血管升壓藥應用、病史與既往史、住院時間、血糖水平等；當供體積分<60 時視為邊緣性供體，>80 為優良供體。后續各大臨床研究中心大多以胰島供體評分系統為基礎來進行 PIT 供體的篩選[14, 30-32]。目前，單從供體自身體質特性而言，選擇年輕（<45 歲）、高 BMI（>30 kg/m2）、血流動力學穩定且肝功能正常的捐贈者，可大大提高胰島分離的產量及成功率[25-26, 33-35]。當供體年齡每超過 1 歲，胰島純化前的產量平均會降低 64 IEQs/g（胰腺重量），相應的分離成功率會下降 1%[34]。高體質量或 BMI 的捐贈者通常具有較大的胰腺，可積極地影響胰島細胞產量，但這并不表示肥胖的捐贈者就是合適的胰腺供體。對于肥胖捐贈者，移植前應確保糖化血紅蛋白處于正常范圍內[36-37]。另有研究表明[38]，對于年齡>40 歲的捐贈者，體表面積可較準確地預估供者胰腺質量[38]，但后續缺乏利用此項指標來進行供胰篩選的深入研究。
既往統計研究表明[35]，DBD 供者較 DCD 供者能提供更高的胰島產量；但 Markmann 等[39]、Andres 等[40]的研究均表明，DCD 與 DBD 來源的胰島細胞具有相似的產量及生物活性。這可能與各研究中心制備分離技術存在差異有關。此外，Hilling 等[34]統計分析發現，在調整其他變量影響的情況下（如年齡、BMI 等），當 DBD 供胰占據較高比例時，胰島分離產量及成功率通常會降低。產生這一現象的可能原因是：① 研究設計差異，既往研究可能未有效地校正其他變量因素的影響，從而對結果判定產生干擾；② 研究中心制備經驗差異，DBD 供者目前是大多數臨床研究中心進行胰島移植物制備的主要來源，而只有經驗豐富的中心才會嘗試 DCD 供者作為替代，從而導致 DCD 供者產生較好分離結果的偏移。近來，由 NIH 發起成立的臨床胰島移植聯盟（CITC）報道了全球第 1 個關于臨床胰島移植物篩選、制備、評價及質控流程的標準[41]。該協議由 CITC 下屬的 8 個 PIT 中心基于多年合作經驗而規范、優化制定，對今后其他來源的胰島移植物的臨床準入也具有重要指導意義。關于 DCD 胰島細胞移植治療 T1DM 的臨床研究主要集中于美國與日本，總體處于小規模嘗試階段；植入胰島后，受體均可獲得良好的血糖控制，部分患者可達到穩定的脫離胰島素狀態[39, 42-44]。現今，更多國家已逐漸接受 DCD 器官移植，并努力推動立法來實現其臨床的合理應用。在我國，目前已制定出臺了《中國心臟死亡捐獻器官評估與應用專家共識》，此共識的達成，對推動、規范我國 DCD 器官捐贈、質量評估等具有極其重要的指導意義[45] 。
1.2 自體來源胰島細胞
胰腺切除術后行自體胰島移植（autologous islet transplantation，AIT），旨在保存胰島素分泌功能及預防糖尿病的發生。胰腺切除術的主要適應證是伴頑固性疼痛的慢性胰腺炎、胰腺良性腫瘤及創傷等。AIT 具有改善患者生活質量、保存胰島功能、術后無需免疫抑制治療、可用于兒童與青少年患者治療等優勢[46-49]。來自明尼蘇達大學 409 例（1977 年—2011 年，含 53 例兒童患者）行胰腺全切+AIT 的慢性胰腺炎患者統計資料顯示[48]：3 年后，30% 患者達到完全脫離胰島素，33% 僅有部分胰島功能并需胰島素輔助；5 年生存率分別為 89%（成人）和 98%（兒童）。AIT 改善代謝的療效常優于同種異體 PIT，但仍主要取決于植入胰島的數量；為較長期地維持功能，至少需要移植>2 500 IEQs/kg 的胰島；此外，低齡（5 ~ 12 歲）、性別及既往無或較少胰腺手術史也是影響 AIT 療效的重要因素[47-50]。目前，如何從已受損或纖維化胰腺中分離出足量、高質量的胰島細胞，是 AIT 所面臨的一個重大挑戰。
2 異種來源胰島細胞
異種 PIT 被認為是解決臨床供胰缺乏的一種具有前景的替代策略。豬因具有以下諸多優點而被認為是最佳的異種胰島供體，如胰島素結構與人類相似、來源充足、易于基因改造、抗自身免疫破壞及較少的倫理問題等[51]。相對于性別、體質量等因素而言，年齡是影響豬胰島產量、大小及功能更為重要的因素[52-53]。胎豬由于胰腺組織體積較小、分化未完全，僅能分離出少量的未成熟胰島細胞，通常需要大量供體以提供充足的移植細胞，以及植入后較長時間（2 ~ 3 個月）以便細胞成熟而發揮降糖功效；這些均不利于臨床前期研究與臨床大規模應用，還會帶來動物倫理問題[51, 54]。通常，>24 月齡的成年豬被視為適宜的異種胰島供體，因其可提供較為充足的具有完整形態、大尺寸（直徑 150 ~ 200 μm）、結構良好的功能性胰島細胞[55-56]。與成年豬胰島相比，新生豬胰島細胞簇（neonatal pig pancreatic cell clusters，NPCCs）具有更為獨特的優勢：良好的缺血/炎性損傷抗性、易于分離純化、低 T 細胞反應性等[57]。NPCCs 有望成為異種胰島另一更有前景的來源。有研究表明[53, 58-59]，<5 日齡新生豬來源的 NPCCs 一般具有較好的活性與功能。目前，由新西蘭 Living Cell Technology 公司研發的膠囊包被 NPCCs 產品“Diabecell”，已進入后期臨床測試階段，并階段性地取得了良好療效。
其次，為有效地降低豬-人移植中人畜共患病的感染幾率，應盡量選擇無特定病原體的豬群。國外的無特定病原體芝加哥小型豬、新西蘭奧克蘭島豬及國內培育的封閉系五指山小型豬、“XENO-1”小型豬等，均是較為實用的異種供體[52]。隨著基因工程技術的發展，以轉基因豬作為異種胰島供體顯示出更為廣闊的應用前景，可有效減少早期移植物丟失、保護植入胰島免受免疫反應攻擊并促進其長期定植[60-61]。同時，多基因改造目前尚未顯示對胰島功能本身具有不良影響[62-63]。隨著 CRISPR/Cas9 等新型、高效基因編輯技術的出現，更大的異種 PIT 進展或將在轉基因豬中取得。
盡管目前豬胰島異種移植已逐漸接近臨床應用，但仍存在一些問題：① 缺乏安全、有效的可實現胰島長期功能性定植的免疫抑制措施。隨著膠囊包被、共刺激通路阻斷等技術的發展與完善，或可達到長期、穩定的移植物免疫保護。② 即刻經血液介導的炎性反應（instant blood-mediated inflammatory reaction，IBMIR）的產生仍是早期胰島丟失或失去功能的主要原因。多基因修飾豬（敲除組織因子并過表達凝血調節因子）[64-65]聯合胰島保形包被技術[66]或可有效地抑制 IBMIR 的發生。③ 如何更為經濟地獲取大量且高質量的功能性豬胰島。應盡快確立簡便、經濟及標準化的豬胰島移植物制備與鑒定標準。④ 生物安全性。存在豬內源性逆轉錄病毒（porcine endogenous retrovirus，PERV）感染人類的風險。雖然目前在已報道的豬-人 PIT 試驗中，尚未發現 PERV 感染現象，但其風險性不容忽視。在開展豬 PIT 前，有必要對可能出現的微生物感染（如 PERV、豬巨細胞病毒及圓環病毒等）進行安全篩查與評估。將來利用更為成熟的基因編輯技術[67]，或可徹底消除生物安全風險。
此外，羅非魚、牛、犬類及靈長類等也可作為異種 PIT 的供體來源，但目前未取得較佳的移植療效。
3 干細胞源性胰島樣細胞
為緩解死亡捐獻供胰所面臨的胰島來源匱乏，研究者們已開始將注意力集中于從干細胞誘導產生功能性胰島 β 細胞或內分泌細胞群。目前，有多種類型的干細胞，至少在體外，可分化為針對葡萄糖刺激產生胰島素分泌反應的 β 樣細胞，如胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）[68]、誘導多能性干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）[69]、MSCs[70-71]、成體組織來源干細胞（肝干細胞、胰腺成體干細胞等）[72]及直接重新編輯體細胞[73-74]等。其中，多能干細胞與重新編輯體細胞（即轉分化）為研究關注較多的領域[75]。
ESCs 擁有發育的全能性。已有研究證實鼠源性與人源性 ESCs 可分化為產胰島素細胞（insulin-producing cells，IPCs）。D’Amour 等[68]在體外模擬胰腺的發育，首次利用五步分化法誘導人 ESCs 經過一系列內胚層中間體分化為具有胰島素、胰高血糖素等激素分泌能力的 IPCs；但分化細胞針對葡萄糖刺激的 C 肽釋放量極其微弱。后續研究進一步表明[76]，ESCs 來源的 IPCs 在糖尿病小鼠體內可分化為成熟的功能性 β 細胞并能改善受體糖代謝。目前，一項由美國 Viacyte 生物技術公司開展的膠囊包被 ESCs 來源胰腺內胚層細胞（ViaCyte VC-01）移植治療 T1DM 的前瞻性臨床試驗（Ⅰ/Ⅱ期，注冊號：NCT02239354）正在招募進行中。然而，ESCs 定向誘導分化 IPCs 策略仍存在特有問題：異體來源細胞的免疫排斥反應與倫理道德限制。iPSCs、MSCs 及成體組織干細胞則可來源于 T1DM 患者本身，幾乎無移植后免疫排斥風險且不受倫理約束，是潛在的胰島細胞來源。事實上，iPSCs 常被認為是自體來源的 ESCs。多個研究小組證實[69, 77]iPSCs 與 ESCs 均可通過相同的誘導方案分化成為 IPCs，且分化效能相似；體內實驗亦表明植入 iPSCs 來源的 IPCs 可使糖尿病小鼠血糖恢復至正常水平 [78-79]。需要說明的是，iPSCs 來源的細胞在自體內仍具有一定免疫原性[80]，其可能原因是由基因操作本身所致（如反轉錄病毒載體整合）。目前，借助于非整合載體、重復 mRNA 轉染及轉座子切除等基因編輯技術，可獲得無載體/轉基因的 iPSCs 細胞株，從而大大降低其在臨床轉化應用過程中存在的安全風險及免疫原性。
由 iPSCs 技術衍生出的另一種重要研究潮流，是將一種體細胞“直接重編程”為另一種終末分化體細胞，此轉分化過程中無需經歷干細胞中間狀態。研究者們利用轉錄因子（transcription factor，TF）的組合來實現體細胞的直接轉分化。通過轉導入 TF 組合（Pdx1+Ngn3+Mafa）可成功使成體小鼠胰腺外分泌細胞[81]、肝細胞[74]及食蟹猴膽管上皮細胞[82]分別轉分化為 IPCs。此外，轉導入 Ngn3、Ngn3+Mafa 可分別使胰腺腺泡細胞（外分泌細胞）直接轉分化為胰島 δ 樣、α 樣細胞[83]。基于不同的 TF 組合，可誘導腺泡細胞直接轉分化而形成較完整的胰島細胞單元，為重建 T1DM 患者內源性胰島素分泌調節系統及擴大移植細胞來源奠定了實驗基礎。此外，成體胰腺的導管組織中含有胰腺前體細胞，已證實具有多向分化潛能，在適宜的刺激誘導條件下可分化為 IPCs。基于此，傳統胰島制備過程中視為廢棄物的組織細胞（如外分泌腺、導管組織等）似乎重新具備可利用價值[84]；有必要進一步改良目前的分離制備技術與流程，以提高胰腺組織的利用率。然而，直接重編輯技術臨床應用前仍需解決一些難題：轉分化效率、穩定性及靶細胞功能欠佳，合適 TF 的確認與選擇，存在表觀遺傳記憶，及基因操作本身所來的免疫排斥風險。
MSCs 除擁有分化潛力大、增殖能力強等干細胞基本特征外，還具備免疫原性低、免疫調節及重建、易于取材分離、便于商業化制備等自身優勢。已有較多研究證實 MSCs 體外可直接誘導分化為 IPCs，體內植入糖尿病動物后可維持其糖代謝于正常范圍[75]。近年 Thakkar 等[85]與 Cai 等[86]研究表明，MSCs 來源 IPCs 或 MSCs+骨髓干細胞共輸注可使 T1DM 患者達到良好的長期（1 年）血糖控制。而對于 2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者，MSCs 輸注可顯著改善患者的胰島功能，部分患者可達到長期（>24 個月）的脫離胰島素[87]。Pan 等[88]近期研究則顯示，MSCs 在 T2DM 樹鼩體內可直接分化為 IPCs 并發揮良好的降糖效果。以上研究均提示 MSCs 有望成為移植治療糖尿病的細胞來源。然而，目前缺乏成熟的 MSCs 分化為功能性 β 細胞的誘導方案，且 MSCs 治療糖尿病的機制尚不完全明確；仍需更多、更深入的實驗及前期臨床研究，為其安全、有效的臨床應用奠定基礎。
目前，干細胞來源 PIT 所面臨的普遍性問題有[89]：① 缺乏明確的干細胞表面標記，干細胞分離、鑒定困難；② 誘導/轉分化成功率及效率較低；③ 獲取的 IPCs 胰島素分泌效能較弱，細胞增殖能力有限，難以大規模商業化生產，且體內植入后遠期效果不穩定；④ 遺傳錯誤、變異及成瘤風險，臨床安全性有待更全面、深入的評估；⑤ 受體自身免疫系統對 IPCs 的破壞。因此，干細胞來源 PIT 治療糖尿病離實際臨床應用仍有較長距離，需要深入研究干細胞分化機制，優化并標準化干細胞制備方法，不斷探索并改良誘導分化條件，規范移植方法與技術，優化免疫抑制策略（如聯合免疫包被、共刺激通路阻斷等技術）。
4 胰島細胞株
盡管胰島 β 細胞具有一定生長能力，但目前尚無可行的體外擴增 β 細胞方法。建立可植入的“永生化”β 細胞系或可徹底解決胰島來源匱乏的難題。目前，國內外研究者已成功建立基于胰島素瘤衍生而來的多種屬 β 細胞系，如 NIT-1（鼠源）、INS-1 （鼠源）、RIN-m5F（鼠源）、Beta-TC-6（鼠源）、EndoC-βH1（人源）、EndoC-βH2（人源）[90-94]，是進行 β 細胞相關研究較為理想的替代品。這些細胞既有強大的增殖潛能，又具備正常 β 細胞的一些重要功能特征，如特異性表型分子表達、胰島素產生與分泌、葡萄糖刺激反應性等，部分細胞系還具有較好的動物模型體內降糖作用。然而，胰島細胞的結構與功能復雜，血糖水平受多種激素精確調控，現有細胞雜交融合或基因重組技術尚不能生產出近乎正常的胰島 β 細胞。胰島細胞株移植離大規模動物及臨床前期試驗仍有較長的距離。此領域的突破或將依賴于對細胞生長發育及基因工程等學科的深入研究。
5 展望
近年來隨著胰島分離制備及移植技術的日趨成熟，臨床 PIT 取得不少成就。然而，即使現有的捐贈供胰均能成功地進行“一對一”PIT，胰島的數量仍遠不能滿足糖尿病患者的需求。因此，尋求異種及由分化或轉分化而來的替代胰島來源具有十分重要的意義。隨著社會捐贈意識的普及與體系的完善，胰島分離及保存、免疫耐受誘導、基因工程、干細胞制備與誘導分化等技術的發展，以及對胰島發生、分化、凋亡等調控機制的深入了解，未來可供移植胰島的來源將會大大豐富，有望推動細胞替代治療成為 T1DM 治療的標準方法之一。
志謝： 西安交通大學醫學院靖寧女士對本文文字編輯做出的重要貢獻
1 型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）是一種全球流行性的慢性自身免疫疾病，對人類健康危害極大[1-3]。外源性胰島素輸注是目前臨床治療 T1DM 的標準療法，但其仍達不到理想的血糖控制，低血糖的發生和微血管病變進展的風險仍然存在。旨在重建內源性胰島素分泌系統的 β 細胞替代治療，因具有維持葡萄糖自穩態的優勢，而逐漸成為關注與研究的熱點[4-7]。目前，臨床可用的 β 細胞替代治療為胰腺移植（pancreas transplantation，PT）和胰島移植（pancreatic islet transplantation，PIT）[8-10]。自 2000 年加拿大 Edmontion 方案取得成功后[11]，隨著免疫調節與細胞制備等技術的改進，PIT 后的血糖控制與長期（3 年、5 年）脫離胰島素的比例現已基本接近 PT[12-16]。與 PT 相比，PIT 具有手術風險低、操作簡便、可體外修飾移植物及多次輸注等優點，是一種極具前景的糖尿病治療方法[5, 13, 15, 17-18]。然而，和器官移植一樣，PIT 面臨的首要挑戰是供體的缺乏[19]，提供充足、合適的供胰來源，是臨床廣泛開展 PIT 治療 T1DM 的前提。現就 PIT 的供體細胞來源作一綜述。
1 同種（人類）來源胰島細胞
1.1 同種異體來源胰島細胞
來自國際協同胰島移植登記處（CITR）2014 年末的統計報告顯示，腦死亡捐贈（donation after brain death，DBD）供胰（同種異體）目前仍是臨床 PIT 的主要供體來源。近年來，心臟死亡捐贈（donation after cardiac death，DCD）供胰逐漸成為另一有效替代細胞來源。與 DBD 相比，DCD 器官通常會遭受更為嚴重的缺血再灌注損傷。DCD 供胰存在外分泌細胞缺血損傷致胰腺炎的風險，不適用于 PT，潛在擴大了供體胰島來源。活體供胰 PIT 曾由日本京都大學于 2005 年首次報道[20-21]，1 例 27 歲女性 T1DM 患者接受了其母親遠端胰腺來源的胰島細胞，術后短期及 1 年隨訪顯示，供、受體均維持著良好的血糖控制狀態。雖然活體供胰具有緩解供體缺乏、胰島活性高（缺血損傷小）等優勢；但供體面臨手術干預，且存在手術致糖尿病及外科并發癥等風險，目前較少應用。
多項研究表明[5, 11, 14]，輸注至少 60 萬胰島當量（islet equivalents，IEQs）的移植物（平均 10 000 IEQs/kg），可使 75% ~ 80% 受者達到理想的胰島素水平。成年人胰腺中大約含有 100 萬個胰島，目前分離純化條件下僅有不足 50% 的胰島細胞可獲取[11, 14, 22]，故一般需要 2 ~ 4 個供胰以滿足 1 個受體的移植需求。以美國為例，每年大約有 8 000 名器官捐贈者，僅有不到 30% 的胰腺器官被用于移植[23-24]。因此，供胰數量遠不能達到 T1DM 患者的需求。此外，多供體來源的 PIT 也會增加受體對人類白細胞抗原致敏的風險幾率。雖然已有成功進行臨床“一對一”PIT 的報道[25-26]，但從多供體全面地過渡到單供體移植階段，仍需要在諸多方面取得進展，比如合適供胰的選擇，冷、熱缺血及消化分離過程中胰島的保護，穩定、高效、低毒的消化酶應用，優化的標準化制備流程，簡便、可靠的移植物效能測評，強效的免疫誘導及促移植物定植策略等[12, 25-27]。Al-Adra 等[26]近年研究表明，受者術前每日胰島素用量<0.6 U/kg 與移植細胞數量>5 646 IEQs/kg，是預測單供體 PIT 后獲得脫離胰島素的兩個獨立影響因素。
為篩選出最佳的胰島供體、減少捐獻者的個體差異對細胞分離結果的影響，O’Gorman 等于 2005 年首次建立起胰島供體評分系統[28-29]。該評分系統對多個供體特征變量進行了評估分析，如年齡、冷缺血時間、體質量指數（body mass index，BMI）、死亡原因、血管升壓藥應用、病史與既往史、住院時間、血糖水平等；當供體積分<60 時視為邊緣性供體，>80 為優良供體。后續各大臨床研究中心大多以胰島供體評分系統為基礎來進行 PIT 供體的篩選[14, 30-32]。目前，單從供體自身體質特性而言，選擇年輕（<45 歲）、高 BMI（>30 kg/m2）、血流動力學穩定且肝功能正常的捐贈者，可大大提高胰島分離的產量及成功率[25-26, 33-35]。當供體年齡每超過 1 歲，胰島純化前的產量平均會降低 64 IEQs/g（胰腺重量），相應的分離成功率會下降 1%[34]。高體質量或 BMI 的捐贈者通常具有較大的胰腺，可積極地影響胰島細胞產量，但這并不表示肥胖的捐贈者就是合適的胰腺供體。對于肥胖捐贈者，移植前應確保糖化血紅蛋白處于正常范圍內[36-37]。另有研究表明[38]，對于年齡>40 歲的捐贈者，體表面積可較準確地預估供者胰腺質量[38]，但后續缺乏利用此項指標來進行供胰篩選的深入研究。
既往統計研究表明[35]，DBD 供者較 DCD 供者能提供更高的胰島產量；但 Markmann 等[39]、Andres 等[40]的研究均表明，DCD 與 DBD 來源的胰島細胞具有相似的產量及生物活性。這可能與各研究中心制備分離技術存在差異有關。此外，Hilling 等[34]統計分析發現，在調整其他變量影響的情況下（如年齡、BMI 等），當 DBD 供胰占據較高比例時，胰島分離產量及成功率通常會降低。產生這一現象的可能原因是：① 研究設計差異，既往研究可能未有效地校正其他變量因素的影響，從而對結果判定產生干擾；② 研究中心制備經驗差異，DBD 供者目前是大多數臨床研究中心進行胰島移植物制備的主要來源，而只有經驗豐富的中心才會嘗試 DCD 供者作為替代，從而導致 DCD 供者產生較好分離結果的偏移。近來，由 NIH 發起成立的臨床胰島移植聯盟（CITC）報道了全球第 1 個關于臨床胰島移植物篩選、制備、評價及質控流程的標準[41]。該協議由 CITC 下屬的 8 個 PIT 中心基于多年合作經驗而規范、優化制定，對今后其他來源的胰島移植物的臨床準入也具有重要指導意義。關于 DCD 胰島細胞移植治療 T1DM 的臨床研究主要集中于美國與日本，總體處于小規模嘗試階段；植入胰島后，受體均可獲得良好的血糖控制，部分患者可達到穩定的脫離胰島素狀態[39, 42-44]。現今，更多國家已逐漸接受 DCD 器官移植，并努力推動立法來實現其臨床的合理應用。在我國，目前已制定出臺了《中國心臟死亡捐獻器官評估與應用專家共識》，此共識的達成，對推動、規范我國 DCD 器官捐贈、質量評估等具有極其重要的指導意義[45] 。
1.2 自體來源胰島細胞
胰腺切除術后行自體胰島移植（autologous islet transplantation，AIT），旨在保存胰島素分泌功能及預防糖尿病的發生。胰腺切除術的主要適應證是伴頑固性疼痛的慢性胰腺炎、胰腺良性腫瘤及創傷等。AIT 具有改善患者生活質量、保存胰島功能、術后無需免疫抑制治療、可用于兒童與青少年患者治療等優勢[46-49]。來自明尼蘇達大學 409 例（1977 年—2011 年，含 53 例兒童患者）行胰腺全切+AIT 的慢性胰腺炎患者統計資料顯示[48]：3 年后，30% 患者達到完全脫離胰島素，33% 僅有部分胰島功能并需胰島素輔助；5 年生存率分別為 89%（成人）和 98%（兒童）。AIT 改善代謝的療效常優于同種異體 PIT，但仍主要取決于植入胰島的數量；為較長期地維持功能，至少需要移植>2 500 IEQs/kg 的胰島；此外，低齡（5 ~ 12 歲）、性別及既往無或較少胰腺手術史也是影響 AIT 療效的重要因素[47-50]。目前，如何從已受損或纖維化胰腺中分離出足量、高質量的胰島細胞，是 AIT 所面臨的一個重大挑戰。
2 異種來源胰島細胞
異種 PIT 被認為是解決臨床供胰缺乏的一種具有前景的替代策略。豬因具有以下諸多優點而被認為是最佳的異種胰島供體，如胰島素結構與人類相似、來源充足、易于基因改造、抗自身免疫破壞及較少的倫理問題等[51]。相對于性別、體質量等因素而言，年齡是影響豬胰島產量、大小及功能更為重要的因素[52-53]。胎豬由于胰腺組織體積較小、分化未完全，僅能分離出少量的未成熟胰島細胞，通常需要大量供體以提供充足的移植細胞，以及植入后較長時間（2 ~ 3 個月）以便細胞成熟而發揮降糖功效；這些均不利于臨床前期研究與臨床大規模應用，還會帶來動物倫理問題[51, 54]。通常，>24 月齡的成年豬被視為適宜的異種胰島供體，因其可提供較為充足的具有完整形態、大尺寸（直徑 150 ~ 200 μm）、結構良好的功能性胰島細胞[55-56]。與成年豬胰島相比，新生豬胰島細胞簇（neonatal pig pancreatic cell clusters，NPCCs）具有更為獨特的優勢：良好的缺血/炎性損傷抗性、易于分離純化、低 T 細胞反應性等[57]。NPCCs 有望成為異種胰島另一更有前景的來源。有研究表明[53, 58-59]，<5 日齡新生豬來源的 NPCCs 一般具有較好的活性與功能。目前，由新西蘭 Living Cell Technology 公司研發的膠囊包被 NPCCs 產品“Diabecell”，已進入后期臨床測試階段，并階段性地取得了良好療效。
其次，為有效地降低豬-人移植中人畜共患病的感染幾率，應盡量選擇無特定病原體的豬群。國外的無特定病原體芝加哥小型豬、新西蘭奧克蘭島豬及國內培育的封閉系五指山小型豬、“XENO-1”小型豬等，均是較為實用的異種供體[52]。隨著基因工程技術的發展，以轉基因豬作為異種胰島供體顯示出更為廣闊的應用前景，可有效減少早期移植物丟失、保護植入胰島免受免疫反應攻擊并促進其長期定植[60-61]。同時，多基因改造目前尚未顯示對胰島功能本身具有不良影響[62-63]。隨著 CRISPR/Cas9 等新型、高效基因編輯技術的出現，更大的異種 PIT 進展或將在轉基因豬中取得。
盡管目前豬胰島異種移植已逐漸接近臨床應用，但仍存在一些問題：① 缺乏安全、有效的可實現胰島長期功能性定植的免疫抑制措施。隨著膠囊包被、共刺激通路阻斷等技術的發展與完善，或可達到長期、穩定的移植物免疫保護。② 即刻經血液介導的炎性反應（instant blood-mediated inflammatory reaction，IBMIR）的產生仍是早期胰島丟失或失去功能的主要原因。多基因修飾豬（敲除組織因子并過表達凝血調節因子）[64-65]聯合胰島保形包被技術[66]或可有效地抑制 IBMIR 的發生。③ 如何更為經濟地獲取大量且高質量的功能性豬胰島。應盡快確立簡便、經濟及標準化的豬胰島移植物制備與鑒定標準。④ 生物安全性。存在豬內源性逆轉錄病毒（porcine endogenous retrovirus，PERV）感染人類的風險。雖然目前在已報道的豬-人 PIT 試驗中，尚未發現 PERV 感染現象，但其風險性不容忽視。在開展豬 PIT 前，有必要對可能出現的微生物感染（如 PERV、豬巨細胞病毒及圓環病毒等）進行安全篩查與評估。將來利用更為成熟的基因編輯技術[67]，或可徹底消除生物安全風險。
此外，羅非魚、牛、犬類及靈長類等也可作為異種 PIT 的供體來源，但目前未取得較佳的移植療效。
3 干細胞源性胰島樣細胞
為緩解死亡捐獻供胰所面臨的胰島來源匱乏，研究者們已開始將注意力集中于從干細胞誘導產生功能性胰島 β 細胞或內分泌細胞群。目前，有多種類型的干細胞，至少在體外，可分化為針對葡萄糖刺激產生胰島素分泌反應的 β 樣細胞，如胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）[68]、誘導多能性干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）[69]、MSCs[70-71]、成體組織來源干細胞（肝干細胞、胰腺成體干細胞等）[72]及直接重新編輯體細胞[73-74]等。其中，多能干細胞與重新編輯體細胞（即轉分化）為研究關注較多的領域[75]。
ESCs 擁有發育的全能性。已有研究證實鼠源性與人源性 ESCs 可分化為產胰島素細胞（insulin-producing cells，IPCs）。D’Amour 等[68]在體外模擬胰腺的發育，首次利用五步分化法誘導人 ESCs 經過一系列內胚層中間體分化為具有胰島素、胰高血糖素等激素分泌能力的 IPCs；但分化細胞針對葡萄糖刺激的 C 肽釋放量極其微弱。后續研究進一步表明[76]，ESCs 來源的 IPCs 在糖尿病小鼠體內可分化為成熟的功能性 β 細胞并能改善受體糖代謝。目前，一項由美國 Viacyte 生物技術公司開展的膠囊包被 ESCs 來源胰腺內胚層細胞（ViaCyte VC-01）移植治療 T1DM 的前瞻性臨床試驗（Ⅰ/Ⅱ期，注冊號：NCT02239354）正在招募進行中。然而，ESCs 定向誘導分化 IPCs 策略仍存在特有問題：異體來源細胞的免疫排斥反應與倫理道德限制。iPSCs、MSCs 及成體組織干細胞則可來源于 T1DM 患者本身，幾乎無移植后免疫排斥風險且不受倫理約束，是潛在的胰島細胞來源。事實上，iPSCs 常被認為是自體來源的 ESCs。多個研究小組證實[69, 77]iPSCs 與 ESCs 均可通過相同的誘導方案分化成為 IPCs，且分化效能相似；體內實驗亦表明植入 iPSCs 來源的 IPCs 可使糖尿病小鼠血糖恢復至正常水平 [78-79]。需要說明的是，iPSCs 來源的細胞在自體內仍具有一定免疫原性[80]，其可能原因是由基因操作本身所致（如反轉錄病毒載體整合）。目前，借助于非整合載體、重復 mRNA 轉染及轉座子切除等基因編輯技術，可獲得無載體/轉基因的 iPSCs 細胞株，從而大大降低其在臨床轉化應用過程中存在的安全風險及免疫原性。
由 iPSCs 技術衍生出的另一種重要研究潮流，是將一種體細胞“直接重編程”為另一種終末分化體細胞，此轉分化過程中無需經歷干細胞中間狀態。研究者們利用轉錄因子（transcription factor，TF）的組合來實現體細胞的直接轉分化。通過轉導入 TF 組合（Pdx1+Ngn3+Mafa）可成功使成體小鼠胰腺外分泌細胞[81]、肝細胞[74]及食蟹猴膽管上皮細胞[82]分別轉分化為 IPCs。此外，轉導入 Ngn3、Ngn3+Mafa 可分別使胰腺腺泡細胞（外分泌細胞）直接轉分化為胰島 δ 樣、α 樣細胞[83]。基于不同的 TF 組合，可誘導腺泡細胞直接轉分化而形成較完整的胰島細胞單元，為重建 T1DM 患者內源性胰島素分泌調節系統及擴大移植細胞來源奠定了實驗基礎。此外，成體胰腺的導管組織中含有胰腺前體細胞，已證實具有多向分化潛能，在適宜的刺激誘導條件下可分化為 IPCs。基于此，傳統胰島制備過程中視為廢棄物的組織細胞（如外分泌腺、導管組織等）似乎重新具備可利用價值[84]；有必要進一步改良目前的分離制備技術與流程，以提高胰腺組織的利用率。然而，直接重編輯技術臨床應用前仍需解決一些難題：轉分化效率、穩定性及靶細胞功能欠佳，合適 TF 的確認與選擇，存在表觀遺傳記憶，及基因操作本身所來的免疫排斥風險。
MSCs 除擁有分化潛力大、增殖能力強等干細胞基本特征外，還具備免疫原性低、免疫調節及重建、易于取材分離、便于商業化制備等自身優勢。已有較多研究證實 MSCs 體外可直接誘導分化為 IPCs，體內植入糖尿病動物后可維持其糖代謝于正常范圍[75]。近年 Thakkar 等[85]與 Cai 等[86]研究表明，MSCs 來源 IPCs 或 MSCs+骨髓干細胞共輸注可使 T1DM 患者達到良好的長期（1 年）血糖控制。而對于 2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者，MSCs 輸注可顯著改善患者的胰島功能，部分患者可達到長期（>24 個月）的脫離胰島素[87]。Pan 等[88]近期研究則顯示，MSCs 在 T2DM 樹鼩體內可直接分化為 IPCs 并發揮良好的降糖效果。以上研究均提示 MSCs 有望成為移植治療糖尿病的細胞來源。然而，目前缺乏成熟的 MSCs 分化為功能性 β 細胞的誘導方案，且 MSCs 治療糖尿病的機制尚不完全明確；仍需更多、更深入的實驗及前期臨床研究，為其安全、有效的臨床應用奠定基礎。
目前，干細胞來源 PIT 所面臨的普遍性問題有[89]：① 缺乏明確的干細胞表面標記，干細胞分離、鑒定困難；② 誘導/轉分化成功率及效率較低；③ 獲取的 IPCs 胰島素分泌效能較弱，細胞增殖能力有限，難以大規模商業化生產，且體內植入后遠期效果不穩定；④ 遺傳錯誤、變異及成瘤風險，臨床安全性有待更全面、深入的評估；⑤ 受體自身免疫系統對 IPCs 的破壞。因此，干細胞來源 PIT 治療糖尿病離實際臨床應用仍有較長距離，需要深入研究干細胞分化機制，優化并標準化干細胞制備方法，不斷探索并改良誘導分化條件，規范移植方法與技術，優化免疫抑制策略（如聯合免疫包被、共刺激通路阻斷等技術）。
4 胰島細胞株
盡管胰島 β 細胞具有一定生長能力，但目前尚無可行的體外擴增 β 細胞方法。建立可植入的“永生化”β 細胞系或可徹底解決胰島來源匱乏的難題。目前，國內外研究者已成功建立基于胰島素瘤衍生而來的多種屬 β 細胞系，如 NIT-1（鼠源）、INS-1 （鼠源）、RIN-m5F（鼠源）、Beta-TC-6（鼠源）、EndoC-βH1（人源）、EndoC-βH2（人源）[90-94]，是進行 β 細胞相關研究較為理想的替代品。這些細胞既有強大的增殖潛能，又具備正常 β 細胞的一些重要功能特征，如特異性表型分子表達、胰島素產生與分泌、葡萄糖刺激反應性等，部分細胞系還具有較好的動物模型體內降糖作用。然而，胰島細胞的結構與功能復雜，血糖水平受多種激素精確調控，現有細胞雜交融合或基因重組技術尚不能生產出近乎正常的胰島 β 細胞。胰島細胞株移植離大規模動物及臨床前期試驗仍有較長的距離。此領域的突破或將依賴于對細胞生長發育及基因工程等學科的深入研究。
5 展望
近年來隨著胰島分離制備及移植技術的日趨成熟，臨床 PIT 取得不少成就。然而，即使現有的捐贈供胰均能成功地進行“一對一”PIT，胰島的數量仍遠不能滿足糖尿病患者的需求。因此，尋求異種及由分化或轉分化而來的替代胰島來源具有十分重要的意義。隨著社會捐贈意識的普及與體系的完善，胰島分離及保存、免疫耐受誘導、基因工程、干細胞制備與誘導分化等技術的發展，以及對胰島發生、分化、凋亡等調控機制的深入了解，未來可供移植胰島的來源將會大大豐富，有望推動細胞替代治療成為 T1DM 治療的標準方法之一。
志謝： 西安交通大學醫學院靖寧女士對本文文字編輯做出的重要貢獻