引用本文： 文華偉, 張青松, 湯明, 李亞楠, 談鴻飛, 方禹舜. 可注射型肌腱干細胞-殼聚糖水凝膠促進兔肩袖腱-骨愈合的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2024, 38(1): 91-98. doi: 10.7507/1002-1892.202309014 復制
肩袖撕裂是一種常見肩部疾病，伴隨關節疼痛和功能受限，通常需要進行肩袖修復手術。然而，修復術后可能發生再撕裂，相關研究報道其發生率達13%～94% [1-2]。肩袖術后再撕裂與多種因素相關，包括初始撕裂嚴重程度、脂肪滲透程度以及肌腱組織質量等[2-4]，術后早期愈合不良也會導致再撕裂發生，腱-骨界面處有大量纖維瘢痕組織形成，而非原位組織再生，導致界面縫隙和低張力組織出現，最終造成修復失敗[5]。早期研究表明，如腱-骨界面存在5 mm間隙，肩袖修復失敗率可達50%，存在10 mm間隙則失敗率達100%[6-7]。因此，促進腱-骨界面愈合、防止縫隙形成被認為是肩袖修復成功的關鍵因素。
近年，研究顯示肌腱干細胞（tendon-derived stem cells，TDSCs）能促進腱-骨界面愈合，減小縫隙，提高結構完整性，從而降低肩袖再撕裂風險，在肌腱損傷治療中具有潛在應用前景[8-10]。但單純TDSCs用于肩袖損傷在細胞存活、定向分化等方面存在諸多問題，影響治療效果[11-12]。殼聚糖（chitosan，CS）是一種由殼著生物質提取而成的多孔結構聚合物，具有良好生物相容性、可降解性和低毒性等特點，目前作為載體已用于藥物傳遞系統、組織工程、生物傳感器等領域 [13-15]。研究發現CS水凝膠負載TDSCs，不僅能為細胞提供一個適宜微環境，還能促進其遷移至損傷部位并增殖，甚至分化，以填補撕裂區域，促進腱-骨界面愈合[8, 10, 16]。此外，CS水凝膠可以在損傷部位直接注入后成型，填充腱-骨界面缺損，為構建注射型肩袖損傷修復材料提供了新途徑[17]。本研究旨在構建可注射型TDSCs-CS水凝膠（以下簡稱TDSCs/CS水凝膠），并用于兔肩袖損傷修復后腱-骨界面，評估其對肩袖腱-骨界面多層梯度組織的誘導再生能力，以期為后續研究奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
成年雄性新西蘭大白兔39只，體質量（3.3±0.8）kg，由武漢市萬千佳興生物科技有限公司提供，實驗前均適應性飼養1周。
CS粉末（武漢聚燦生物科技有限公司）；DMEM/F12培養基、成骨誘導分化完全培養基、成脂誘導分化完全培養基、成軟骨誘導分化完全培養基（武漢普諾賽生命科技有限公司）；Dulbecco改良Eagle培養基、PBS緩沖液、0.25%胰蛋白酶（武漢塞維爾生物科技有限公司）；醋酸、N-羥基乙酰化CS（N-hydroxy acetylation-CS，N-HA-CS）、DMSO（Sigma-Aldrich公司，美國）；定量SYBR Green PCR試劑盒、RNeasy Mini Kit逆轉錄試劑盒（TaKaRa公司，日本）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8；武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；HE染色試劑盒、Masson染色液、茜紅素染色液、油紅O染色液、阿利新藍染色液（武漢索萊寶生物科技有限公司）。
BX43顯微鏡（Olympus公司，日本）；酶標儀、流式細胞儀、細胞培養箱（Thermo公司，美國）；實時定量PCR儀（BioRad公司，美國）；生物力學檢測儀（Orientec公司，日本）。
1.2 TDSCs分離培養與鑒定
采用Henderson分步酶消化法分離培養TDSCs。取3只新西蘭大白兔經腹腔注射3%戊巴比妥鈉過量麻醉處死，于無菌條件下取肩袖組織，剝離附著的筋膜和鞘膜；將岡上肌及岡下肌肌腱切碎后置于0.25%胰蛋白酶和0.1%Ⅰ型膠原酶消化2 h，將逸出的細胞經PBS緩沖液沖洗后，懸浮于Dulbecco改良Eagle培養基中；將分離出的有核細胞制成細胞懸液，細胞計數5×105個接種于25 mL培養瓶中培養。原代細胞融合成單層細胞后，以4 000 個/cm2密度傳代培養，取第3代進行后續實驗。
常規進行干細胞表型鑒定和多向分化潛能實驗[16]。采用流式細胞儀檢測PE標記的細胞表面標記物CD44、CD105、CD14、CD45表達，其中CD105、CD44表達陽性，CD14、CD45表達陰性。取TDSCs以2×104個/孔接種于6孔板，分別加入成骨、成脂、成軟骨誘導分化完全培養基，培養2周后分別進行茜紅素染色、油紅O染色和阿利新藍染色，結果顯示均呈陽性。上述實驗結果提示分離培養細胞為TDSCs，可進行后續實驗。
1.3 TDSCs/CS水凝膠制備及觀測
1.3.1 水凝膠制備方法
將1 g CS粉末加入100 mL 5%醋酸中，攪拌溶解形成1% CS溶液，進一步添加50 mg N-HA-CS，充分攪拌混合后采用5% NaOH調整溶液pH值至7.2～7.4，以促進水凝膠形成。將交聯劑0.5% DMSO加入含有N-HA-CS的CS溶液，充分混合后于室溫靜置，使其逐漸形成CS水凝膠。將水凝膠樣本收集到離心管中，以離心半徑15 cm、2 000 r/min 離心5 min×3次并PBS緩沖液反復洗滌，以去除殘余醋酸和交聯劑。將洗滌后的CS水凝膠置于冷凍離心機中?20℃冷凍，使其形成冷凍水凝膠備用。實驗前，將冷凍水凝膠在室溫下解凍，使其恢復至可注射狀態。
無菌條件下，使用移液器將TDSCs細胞懸液（細胞計數2×105個）加入至可注射型CS水凝膠（0.5 mL）中，并輕輕攪拌確保細胞與水凝膠充分混合形成TDSCs/CS水凝膠，于–20℃儲存備用。
1.3.2 水凝膠細胞相容性檢測
取對數生長期TDSCs用0.25%胰蛋白酶消化，配置成濃度為2×105個/mL細胞懸液，與1.3.1中制備的CS水凝膠（0.5 mL）混勻后接種于96孔板，每孔150 μL，作為TDSCs/CS水凝膠組；以單純TDSCs培養作為對照（TDSCs組），每孔100 μL。兩組于37℃、5%CO2條件下采用DMEM/F12培養基培養，培養1、2、3、4、5 d每組各取5孔加入10 μL CCK-8溶液后繼續培養2 h，使用酶標儀測定450 nm處吸光度（A）值，并繪制生長曲線。
1.4 動物體內實驗
1.4.1 實驗分組及方法
將36只新西蘭大白兔隨機分為3組（n=12），分別為肩袖修復組（對照組）、肩袖修復+CS水凝膠注射組（CS組）、肩袖修復+ TDSCs/CS水凝膠注射組（TDSCs/CS組）。
3組動物經腹腔注射3%戊巴比妥（40 mg/kg）麻醉，手術期間保持3%異氟醚吸入。無菌條件下，于雙側肩關節作長1.5 cm皮膚切口，逐層剝離皮下組織，分離三角肌，顯露肩袖。在肩袖大結節止點離斷岡上肌肌腱后，用手術刀刮除大結節上肩袖殘余組織以及軟骨，使足印區形成有血漬的粗糙表面，采用單排修復技術縫合岡上肌肌腱至大結節止點。然后，CS組及TDSCs/CS組將對應的水凝膠注射至肩袖腱-骨界面，每一側注射0.5 mL，紫外線照射60 s使水凝膠固化；對照組不作其他處理。3組生理鹽水沖洗切口后分層閉合。見圖1。
圖1
肩袖修復手術示意圖
a. 作切口暴露肩關節；b. 分離三角肌暴露肩袖；c. 離斷岡上肌肌腱；d. 縫合岡上肌肌腱并注射水凝膠（箭頭）
Figure1. Schematic diagram of rotator cuff repair surgerya. Made an incision to expose the shoulder joint; b. Separated deltoid muscle to expose rotator cuff; c. Transected the supraspinatus tendon; d. Sutured the supraspinatus tendon and injected hydrogel (arrow)
術后動物分籠飼養，籠中自由活動。術后4周每組取3只（6個樣本）、8周取9只（18個樣本）動物，靜脈注射過量3%戊巴比妥處死后，按照原切口入路切除雙側肩關節，軟組織部分僅保留岡上肌肌腱，去除其余附屬組織后進行相關觀測。
1.4.2 觀測指標
① 一般情況：觀察術后兩組動物存活情況以及切口愈合、肢體功能恢復情況。
② 腱-骨界面相關基因檢測：采用實時定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）檢測腱-骨界面成肌腱相關基因腱調蛋白（tenomodulin，Tnmd）、轉錄因子（scleraxis，Scx），成軟骨相關基因蛋白聚糖（aggrecan，ACAN）、性別決定區Y框蛋白9（sex determining region Y-related high mobility group-box gene 9，Sox9），成骨相關基因ALP和人Runt相關轉錄因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）表達。
術后4、8周，各組取3只動物（6個樣本）用PBS緩沖液漂洗后，液氮研磨并加入DNaseⅠ酶裂解以釋放總RNA。然后將總RNA使用RNeasy Mini Kit逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA模版，隨后使用定量SYBR Green PCR試劑盒進行目的基因擴增，引物序列見表1。以GAPDH為內參引物，計算腱-骨界面相關基因相對表達量。
表1
qPCR引物序列（5′→3′）
Table1.
Primer sequences of qPCR（5′→3′）
③ 組織學觀察：術后8周每組取3只動物（6個樣本），經固定脫鈣后沿肌腱長軸切開，暴露肩袖腱-骨連接處，石蠟包埋，制成4 μm厚切片。常規HE染色觀察組織學特征，Masson染色觀察纖維軟骨分布。采用Image J圖像分析軟件基于HE染色圖片參照半定量組織學評分系統對修復效果進行評分[6]，評分項目包括細胞數量（%）、血管數量（條）和膠原纖維分布（%），計算修復效果總分。
④ 生物力學測試：術后8周每組取3只動物（6個樣本）進行生物力學測試。將標本肌腱、肱骨頭用縫線固定于生物力學檢測儀，每個樣本預加載至10 N，然后以5 mm/s速度加載，記錄肩袖斷裂失效時極限載荷和失效部位。
1.5 統計學方法
采用SPSS26.0統計軟件進行分析。計量資料采用Shapiro-Wilk檢驗進行正態性檢驗，均符合正態分布，以均數±標準差表示；三組多時間點比較采用析因設計方差分析；組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 TDSCs/CS水凝膠細胞相容性檢測
隨著時間延長，兩組細胞數量穩定增長（P<0.05）。培養1 d時兩組A值差異無統計學意義（P>0.05）；培養2～5 d時，TDSCs/CS水凝膠組A值高于TDSCs組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖2。
圖2
CCK-8檢測細胞增殖
Figure2.
Cell proliferation measured by CCK-8 assay
2.2 動物體內實驗
2.2.1 一般情況
術后各組動物均存活至實驗完成，手術切口均未見紅腫、滲液、感染等癥狀，2周后動物四肢活動無明顯異常。
2.2.2 腱-骨界面相關基因檢測
術后4、8周，TSDCs/CS組成肌腱、成軟骨、成骨相關基因相對表達量均高于CS組和對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。TDSCs/CS組組內比較，與術后4周相比，術后8周上述基因相對表達量亦增加，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖3。
圖3
腱-骨界面相關基因相對表達量
Figure3.
Relative expressions of tendon-to-bone interface related genes
2.2.3 組織學觀察
術后8周，HE染色示對照組腱-骨界面處存在高度血管化和無序肉芽組織，CS組腱-骨界面處可見疏松膠原纖維，而TDSCs/CS組腱-骨界面處可見致密有序的膠原纖維，且膠原纖維呈現一定程度組織學變化，具有較清晰的三層結構形成。見圖4a。Masson染色示對照組和CS組藍染區域較少，而TDSCs/CS組呈現大量藍染膠原纖維組織，提示有大量膠原生成和沉積，且可見一定量纖維軟骨形成。見圖4b。
圖4
術后8周組織學觀察（×20）
從左至右分別為TSDCs/CS組、CS組、對照組 a. HE染色；b. Masson染色
Figure4. Histological observation at 8 weeks after operation (×20)From left to right for TSDCs/CS group, CS group, and control group, respectively a. HE staining; b. Masson staining
半定量組織學評估顯示，TDSCs/CS組與對照組相比，細胞數量、膠原纖維分布以及組織學評分增高，血管數量降低，差異有統計學意義（P<0.05）；與CS組相比，膠原纖維分布、組織學評分均增高，差異有統計學意義（P<0.05），但細胞數量、血管數量差異無統計學意義（P>0.05）。見表2、3。
表2
組織學評分組間比較結果（n=3，
）
Table2.
Results of histological scores between groups (n=3, 
)
表3
組織學評分組間兩兩比較結果
Table3.
Pairwise comparison results of histological scores between groups
2.2.4 生物力學檢測情況
術后8周，對岡上肌肌腱-骨修復標本進行生物力學檢測。所有樣本測試過程中均在修復部位失效。對照組、CS組、TDSCs/CS組極限載荷分別為（69.45±11.47）、（106.70±14.50）、（113.02±10.65） N。TDSCs/CS組極限載荷高于對照組，差異有統計學意義（P <0.05）；但與CS組差異無統計學意義（P>0.05）。
3 討論
肩袖修復術后腱-骨界面特殊的多層梯度式結構難以再生，常伴以界面縫隙和低張力組織形成，存在肩袖再撕裂風險。隨著組織工程學發展，各種生物材料、干細胞、生長因子被用于肩袖修復中，通過防止界面縫隙和低張力組織形成、促進纖維軟骨組織形成，以期促進腱-骨界面愈合。
干細胞治療作為一種新興的治療策略為肩袖損傷修復提供了新方法。既往研究發現，相較于傳統的BMSCs、脂肪來源MSCs，TDSCs表現出更高的生物活性，Tnmd、Ⅰ型膠原和Scx表達水平更高，更有利于腱-骨界面形成[8, 10, 18-23]。此外，TDSCs本身即參與了肩袖腱-骨愈合過程，它們能遷移至受傷部位，增殖并分化為肌腱細胞、軟骨細胞、骨細胞，促進修復[22-24]。這些細胞有助于填補撕裂區域，減少纖維瘢痕組織形成，從而提高愈合質量[25]。總的來說，TDSCs在促進腱-骨界面愈合能力方面較BMSCs等傳統干細胞更具優勢，能保證腱-骨止點處生成更多肌腱與骨，且增殖能力更強。
本研究采用CS水凝膠作為載體，將TDSCs注射在兔肩袖損傷部位后紫外線照射固化，可有效避免以往可注射型材料無法在止點處穩定持續發揮作用的問題。Abourehab等[26]和Willbold等[27]的研究證實CS因其特殊的生物活性和生物相容性，具有促進細胞增殖作用。本研究結果顯示，CS水凝膠為TDSCs提供了合適的微環境，促進了細胞的增殖和分化。此外，術后4、8周時TDSCs/CS組腱-骨界面相關基因表達均明顯上調，說明TDSCs/CS水凝膠在分子水平上調控了愈合過程，能夠促進腱-骨界面的細胞分化和組織再生。尤其是術后8周基因表達進一步上調，表明TDSCs/CS水凝膠在長期愈合過程中持續發揮作用，有助于軟骨和骨組織再生。生物力學測試結果顯示，TDSCs/CS組極限載荷明顯高于對照組，提示TDSCs/CS水凝膠能夠增強肩袖腱-骨界面結合強度；但是與CS組差異無統計學意義，分析可能與觀察時間較短，尚不足以顯示差異或者CS組可能存在其他生物學效應相關。
綜上述，TDSCs/CS水凝膠是一種有效的促進肩袖腱-骨界面愈合材料，為肩袖損傷的治療帶來了創新性解決方案。但是本研究仍存在一些不足和局限性。首先，研究觀察時間較短，尚需進一步研究驗證TDSCs/CS水凝膠在體內的長期效果和安全性。其次，盡管CS水凝膠作為載體提供了合適細胞生長的微環境，但其機械性能仍相對較低，而肩袖區域運動范圍和負荷較大，這可能對肩袖修復的穩定性和耐久性構成挑戰[28]。因此，有必要改進CS的性能，以提高其在體內的穩定性和機械支持性。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對數據研究客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經華中科技大學實驗動物倫理委員會批準；實驗動物使用許可證號：SYXK（鄂）2021-0114
作者貢獻聲明 方禹舜：研究設計以及校閱文章；文華偉：水凝膠制備、動物造模、論文撰寫；張青松：指導實驗操作；湯明：負責部分實驗內容及數據分析；李亞楠、談鴻飛：數據整理與分析
肩袖撕裂是一種常見肩部疾病，伴隨關節疼痛和功能受限，通常需要進行肩袖修復手術。然而，修復術后可能發生再撕裂，相關研究報道其發生率達13%～94% [1-2]。肩袖術后再撕裂與多種因素相關，包括初始撕裂嚴重程度、脂肪滲透程度以及肌腱組織質量等[2-4]，術后早期愈合不良也會導致再撕裂發生，腱-骨界面處有大量纖維瘢痕組織形成，而非原位組織再生，導致界面縫隙和低張力組織出現，最終造成修復失敗[5]。早期研究表明，如腱-骨界面存在5 mm間隙，肩袖修復失敗率可達50%，存在10 mm間隙則失敗率達100%[6-7]。因此，促進腱-骨界面愈合、防止縫隙形成被認為是肩袖修復成功的關鍵因素。
近年，研究顯示肌腱干細胞（tendon-derived stem cells，TDSCs）能促進腱-骨界面愈合，減小縫隙，提高結構完整性，從而降低肩袖再撕裂風險，在肌腱損傷治療中具有潛在應用前景[8-10]。但單純TDSCs用于肩袖損傷在細胞存活、定向分化等方面存在諸多問題，影響治療效果[11-12]。殼聚糖（chitosan，CS）是一種由殼著生物質提取而成的多孔結構聚合物，具有良好生物相容性、可降解性和低毒性等特點，目前作為載體已用于藥物傳遞系統、組織工程、生物傳感器等領域 [13-15]。研究發現CS水凝膠負載TDSCs，不僅能為細胞提供一個適宜微環境，還能促進其遷移至損傷部位并增殖，甚至分化，以填補撕裂區域，促進腱-骨界面愈合[8, 10, 16]。此外，CS水凝膠可以在損傷部位直接注入后成型，填充腱-骨界面缺損，為構建注射型肩袖損傷修復材料提供了新途徑[17]。本研究旨在構建可注射型TDSCs-CS水凝膠（以下簡稱TDSCs/CS水凝膠），并用于兔肩袖損傷修復后腱-骨界面，評估其對肩袖腱-骨界面多層梯度組織的誘導再生能力，以期為后續研究奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
成年雄性新西蘭大白兔39只，體質量（3.3±0.8）kg，由武漢市萬千佳興生物科技有限公司提供，實驗前均適應性飼養1周。
CS粉末（武漢聚燦生物科技有限公司）；DMEM/F12培養基、成骨誘導分化完全培養基、成脂誘導分化完全培養基、成軟骨誘導分化完全培養基（武漢普諾賽生命科技有限公司）；Dulbecco改良Eagle培養基、PBS緩沖液、0.25%胰蛋白酶（武漢塞維爾生物科技有限公司）；醋酸、N-羥基乙酰化CS（N-hydroxy acetylation-CS，N-HA-CS）、DMSO（Sigma-Aldrich公司，美國）；定量SYBR Green PCR試劑盒、RNeasy Mini Kit逆轉錄試劑盒（TaKaRa公司，日本）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8；武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；HE染色試劑盒、Masson染色液、茜紅素染色液、油紅O染色液、阿利新藍染色液（武漢索萊寶生物科技有限公司）。
BX43顯微鏡（Olympus公司，日本）；酶標儀、流式細胞儀、細胞培養箱（Thermo公司，美國）；實時定量PCR儀（BioRad公司，美國）；生物力學檢測儀（Orientec公司，日本）。
1.2 TDSCs分離培養與鑒定
采用Henderson分步酶消化法分離培養TDSCs。取3只新西蘭大白兔經腹腔注射3%戊巴比妥鈉過量麻醉處死，于無菌條件下取肩袖組織，剝離附著的筋膜和鞘膜；將岡上肌及岡下肌肌腱切碎后置于0.25%胰蛋白酶和0.1%Ⅰ型膠原酶消化2 h，將逸出的細胞經PBS緩沖液沖洗后，懸浮于Dulbecco改良Eagle培養基中；將分離出的有核細胞制成細胞懸液，細胞計數5×105個接種于25 mL培養瓶中培養。原代細胞融合成單層細胞后，以4 000 個/cm2密度傳代培養，取第3代進行后續實驗。
常規進行干細胞表型鑒定和多向分化潛能實驗[16]。采用流式細胞儀檢測PE標記的細胞表面標記物CD44、CD105、CD14、CD45表達，其中CD105、CD44表達陽性，CD14、CD45表達陰性。取TDSCs以2×104個/孔接種于6孔板，分別加入成骨、成脂、成軟骨誘導分化完全培養基，培養2周后分別進行茜紅素染色、油紅O染色和阿利新藍染色，結果顯示均呈陽性。上述實驗結果提示分離培養細胞為TDSCs，可進行后續實驗。
1.3 TDSCs/CS水凝膠制備及觀測
1.3.1 水凝膠制備方法
將1 g CS粉末加入100 mL 5%醋酸中，攪拌溶解形成1% CS溶液，進一步添加50 mg N-HA-CS，充分攪拌混合后采用5% NaOH調整溶液pH值至7.2～7.4，以促進水凝膠形成。將交聯劑0.5% DMSO加入含有N-HA-CS的CS溶液，充分混合后于室溫靜置，使其逐漸形成CS水凝膠。將水凝膠樣本收集到離心管中，以離心半徑15 cm、2 000 r/min 離心5 min×3次并PBS緩沖液反復洗滌，以去除殘余醋酸和交聯劑。將洗滌后的CS水凝膠置于冷凍離心機中?20℃冷凍，使其形成冷凍水凝膠備用。實驗前，將冷凍水凝膠在室溫下解凍，使其恢復至可注射狀態。
無菌條件下，使用移液器將TDSCs細胞懸液（細胞計數2×105個）加入至可注射型CS水凝膠（0.5 mL）中，并輕輕攪拌確保細胞與水凝膠充分混合形成TDSCs/CS水凝膠，于–20℃儲存備用。
1.3.2 水凝膠細胞相容性檢測
取對數生長期TDSCs用0.25%胰蛋白酶消化，配置成濃度為2×105個/mL細胞懸液，與1.3.1中制備的CS水凝膠（0.5 mL）混勻后接種于96孔板，每孔150 μL，作為TDSCs/CS水凝膠組；以單純TDSCs培養作為對照（TDSCs組），每孔100 μL。兩組于37℃、5%CO2條件下采用DMEM/F12培養基培養，培養1、2、3、4、5 d每組各取5孔加入10 μL CCK-8溶液后繼續培養2 h，使用酶標儀測定450 nm處吸光度（A）值，并繪制生長曲線。
1.4 動物體內實驗
1.4.1 實驗分組及方法
將36只新西蘭大白兔隨機分為3組（n=12），分別為肩袖修復組（對照組）、肩袖修復+CS水凝膠注射組（CS組）、肩袖修復+ TDSCs/CS水凝膠注射組（TDSCs/CS組）。
3組動物經腹腔注射3%戊巴比妥（40 mg/kg）麻醉，手術期間保持3%異氟醚吸入。無菌條件下，于雙側肩關節作長1.5 cm皮膚切口，逐層剝離皮下組織，分離三角肌，顯露肩袖。在肩袖大結節止點離斷岡上肌肌腱后，用手術刀刮除大結節上肩袖殘余組織以及軟骨，使足印區形成有血漬的粗糙表面，采用單排修復技術縫合岡上肌肌腱至大結節止點。然后，CS組及TDSCs/CS組將對應的水凝膠注射至肩袖腱-骨界面，每一側注射0.5 mL，紫外線照射60 s使水凝膠固化；對照組不作其他處理。3組生理鹽水沖洗切口后分層閉合。見圖1。
圖1
肩袖修復手術示意圖
a. 作切口暴露肩關節；b. 分離三角肌暴露肩袖；c. 離斷岡上肌肌腱；d. 縫合岡上肌肌腱并注射水凝膠（箭頭）
Figure1. Schematic diagram of rotator cuff repair surgerya. Made an incision to expose the shoulder joint; b. Separated deltoid muscle to expose rotator cuff; c. Transected the supraspinatus tendon; d. Sutured the supraspinatus tendon and injected hydrogel (arrow)
術后動物分籠飼養，籠中自由活動。術后4周每組取3只（6個樣本）、8周取9只（18個樣本）動物，靜脈注射過量3%戊巴比妥處死后，按照原切口入路切除雙側肩關節，軟組織部分僅保留岡上肌肌腱，去除其余附屬組織后進行相關觀測。
1.4.2 觀測指標
① 一般情況：觀察術后兩組動物存活情況以及切口愈合、肢體功能恢復情況。
② 腱-骨界面相關基因檢測：采用實時定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）檢測腱-骨界面成肌腱相關基因腱調蛋白（tenomodulin，Tnmd）、轉錄因子（scleraxis，Scx），成軟骨相關基因蛋白聚糖（aggrecan，ACAN）、性別決定區Y框蛋白9（sex determining region Y-related high mobility group-box gene 9，Sox9），成骨相關基因ALP和人Runt相關轉錄因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）表達。
術后4、8周，各組取3只動物（6個樣本）用PBS緩沖液漂洗后，液氮研磨并加入DNaseⅠ酶裂解以釋放總RNA。然后將總RNA使用RNeasy Mini Kit逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA模版，隨后使用定量SYBR Green PCR試劑盒進行目的基因擴增，引物序列見表1。以GAPDH為內參引物，計算腱-骨界面相關基因相對表達量。
表1
qPCR引物序列（5′→3′）
Table1.
Primer sequences of qPCR（5′→3′）
③ 組織學觀察：術后8周每組取3只動物（6個樣本），經固定脫鈣后沿肌腱長軸切開，暴露肩袖腱-骨連接處，石蠟包埋，制成4 μm厚切片。常規HE染色觀察組織學特征，Masson染色觀察纖維軟骨分布。采用Image J圖像分析軟件基于HE染色圖片參照半定量組織學評分系統對修復效果進行評分[6]，評分項目包括細胞數量（%）、血管數量（條）和膠原纖維分布（%），計算修復效果總分。
④ 生物力學測試：術后8周每組取3只動物（6個樣本）進行生物力學測試。將標本肌腱、肱骨頭用縫線固定于生物力學檢測儀，每個樣本預加載至10 N，然后以5 mm/s速度加載，記錄肩袖斷裂失效時極限載荷和失效部位。
1.5 統計學方法
采用SPSS26.0統計軟件進行分析。計量資料采用Shapiro-Wilk檢驗進行正態性檢驗，均符合正態分布，以均數±標準差表示；三組多時間點比較采用析因設計方差分析；組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 TDSCs/CS水凝膠細胞相容性檢測
隨著時間延長，兩組細胞數量穩定增長（P<0.05）。培養1 d時兩組A值差異無統計學意義（P>0.05）；培養2～5 d時，TDSCs/CS水凝膠組A值高于TDSCs組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖2。
圖2
CCK-8檢測細胞增殖
Figure2.
Cell proliferation measured by CCK-8 assay
2.2 動物體內實驗
2.2.1 一般情況
術后各組動物均存活至實驗完成，手術切口均未見紅腫、滲液、感染等癥狀，2周后動物四肢活動無明顯異常。
2.2.2 腱-骨界面相關基因檢測
術后4、8周，TSDCs/CS組成肌腱、成軟骨、成骨相關基因相對表達量均高于CS組和對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。TDSCs/CS組組內比較，與術后4周相比，術后8周上述基因相對表達量亦增加，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖3。
圖3
腱-骨界面相關基因相對表達量
Figure3.
Relative expressions of tendon-to-bone interface related genes
2.2.3 組織學觀察
術后8周，HE染色示對照組腱-骨界面處存在高度血管化和無序肉芽組織，CS組腱-骨界面處可見疏松膠原纖維，而TDSCs/CS組腱-骨界面處可見致密有序的膠原纖維，且膠原纖維呈現一定程度組織學變化，具有較清晰的三層結構形成。見圖4a。Masson染色示對照組和CS組藍染區域較少，而TDSCs/CS組呈現大量藍染膠原纖維組織，提示有大量膠原生成和沉積，且可見一定量纖維軟骨形成。見圖4b。
圖4
術后8周組織學觀察（×20）
從左至右分別為TSDCs/CS組、CS組、對照組 a. HE染色；b. Masson染色
Figure4. Histological observation at 8 weeks after operation (×20)From left to right for TSDCs/CS group, CS group, and control group, respectively a. HE staining; b. Masson staining
半定量組織學評估顯示，TDSCs/CS組與對照組相比，細胞數量、膠原纖維分布以及組織學評分增高，血管數量降低，差異有統計學意義（P<0.05）；與CS組相比，膠原纖維分布、組織學評分均增高，差異有統計學意義（P<0.05），但細胞數量、血管數量差異無統計學意義（P>0.05）。見表2、3。
表2
組織學評分組間比較結果（n=3，）
Table2.
Results of histological scores between groups (n=3, )
表3
組織學評分組間兩兩比較結果
Table3.
Pairwise comparison results of histological scores between groups
2.2.4 生物力學檢測情況
術后8周，對岡上肌肌腱-骨修復標本進行生物力學檢測。所有樣本測試過程中均在修復部位失效。對照組、CS組、TDSCs/CS組極限載荷分別為（69.45±11.47）、（106.70±14.50）、（113.02±10.65） N。TDSCs/CS組極限載荷高于對照組，差異有統計學意義（P <0.05）；但與CS組差異無統計學意義（P>0.05）。
3 討論
肩袖修復術后腱-骨界面特殊的多層梯度式結構難以再生，常伴以界面縫隙和低張力組織形成，存在肩袖再撕裂風險。隨著組織工程學發展，各種生物材料、干細胞、生長因子被用于肩袖修復中，通過防止界面縫隙和低張力組織形成、促進纖維軟骨組織形成，以期促進腱-骨界面愈合。
干細胞治療作為一種新興的治療策略為肩袖損傷修復提供了新方法。既往研究發現，相較于傳統的BMSCs、脂肪來源MSCs，TDSCs表現出更高的生物活性，Tnmd、Ⅰ型膠原和Scx表達水平更高，更有利于腱-骨界面形成[8, 10, 18-23]。此外，TDSCs本身即參與了肩袖腱-骨愈合過程，它們能遷移至受傷部位，增殖并分化為肌腱細胞、軟骨細胞、骨細胞，促進修復[22-24]。這些細胞有助于填補撕裂區域，減少纖維瘢痕組織形成，從而提高愈合質量[25]。總的來說，TDSCs在促進腱-骨界面愈合能力方面較BMSCs等傳統干細胞更具優勢，能保證腱-骨止點處生成更多肌腱與骨，且增殖能力更強。
本研究采用CS水凝膠作為載體，將TDSCs注射在兔肩袖損傷部位后紫外線照射固化，可有效避免以往可注射型材料無法在止點處穩定持續發揮作用的問題。Abourehab等[26]和Willbold等[27]的研究證實CS因其特殊的生物活性和生物相容性，具有促進細胞增殖作用。本研究結果顯示，CS水凝膠為TDSCs提供了合適的微環境，促進了細胞的增殖和分化。此外，術后4、8周時TDSCs/CS組腱-骨界面相關基因表達均明顯上調，說明TDSCs/CS水凝膠在分子水平上調控了愈合過程，能夠促進腱-骨界面的細胞分化和組織再生。尤其是術后8周基因表達進一步上調，表明TDSCs/CS水凝膠在長期愈合過程中持續發揮作用，有助于軟骨和骨組織再生。生物力學測試結果顯示，TDSCs/CS組極限載荷明顯高于對照組，提示TDSCs/CS水凝膠能夠增強肩袖腱-骨界面結合強度；但是與CS組差異無統計學意義，分析可能與觀察時間較短，尚不足以顯示差異或者CS組可能存在其他生物學效應相關。
綜上述，TDSCs/CS水凝膠是一種有效的促進肩袖腱-骨界面愈合材料，為肩袖損傷的治療帶來了創新性解決方案。但是本研究仍存在一些不足和局限性。首先，研究觀察時間較短，尚需進一步研究驗證TDSCs/CS水凝膠在體內的長期效果和安全性。其次，盡管CS水凝膠作為載體提供了合適細胞生長的微環境，但其機械性能仍相對較低，而肩袖區域運動范圍和負荷較大，這可能對肩袖修復的穩定性和耐久性構成挑戰[28]。因此，有必要改進CS的性能，以提高其在體內的穩定性和機械支持性。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對數據研究客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經華中科技大學實驗動物倫理委員會批準；實驗動物使用許可證號：SYXK（鄂）2021-0114
作者貢獻聲明 方禹舜：研究設計以及校閱文章；文華偉：水凝膠制備、動物造模、論文撰寫；張青松：指導實驗操作；湯明：負責部分實驗內容及數據分析；李亞楠、談鴻飛：數據整理與分析
