引用本文： 鄭婷婷, 朱倍瑤, 王智超, 李青峰. Ⅰ型神經纖維瘤病的基因治療策略與前景. 中國修復重建外科雜志, 2024, 38(1): 1-8. doi: 10.7507/1002-1892.202309071 復制
Ⅰ型神經纖維瘤病（neurofibromatosis type 1，NF1）又稱Von Recklinghausen病，是由NF1基因突變引起的常染色體顯性遺傳性疾病，據統計全球新生兒發病率約為1/3 000[1-2]，其中約50%為散發型突變。患者多幼年起病，臨床表現多樣，如咖啡牛奶斑、腋窩或腹股溝淡褐色雀斑和多發性神經纖維瘤，同時往往存在多系統受累，包括并發多種良、惡性腫瘤，骨骼發育異常，心腦血管疾病，認知和心理異常等[3-6]。神經纖維瘤是NF1特征性癥狀之一，分為皮膚型神經纖維瘤（cutaneous neurofibroma，cNF）和叢狀神經纖維瘤（plexiform neurofibroma，pNF）。其中，pNF多呈浸潤性生長，破壞周圍正常組織和器官，8%～13% pNF會轉為惡性周圍神經鞘瘤[7-9]。目前，NF1主要以手術、藥物等對癥治療為主，雖能緩解癥狀，但不能根治疾病。
基因治療是一種新興技術，主要包括轉基因和基因編輯兩大技術路徑，目前已經在單基因遺傳病治療中顯示出了巨大應用潛力。由于NF1是單基因功能喪失所致，因此可以通過傳遞轉基因取代或糾正有缺陷基因，從而達到治療目的。現就NF1的基因治療研究進展及前景作一綜述，以期為后續研究提供參考。
1 NF1基因的結構與功能
1.1 NF1基因的結構
NF1基因是人類基因組中最大的基因之一，定位于17q11.2，全長350 kb，由61個外顯子組成，編碼一段長11～13 kb的mRNA[10-11]。其中最大的27號內含子包含了外翻病毒插入部位基因（entropic viral insertion site gene，EVI）的2個亞型EVI2A、EVI2B以及少突神經膠質細胞髓磷脂糖蛋白等3個鑲嵌基因[12]。這些鑲嵌基因的功能尚不清楚，可能對NF1的臨床表型有一定影響。此外，NF1基因有4種剪接變體，呈現發育時期和組織特異性表達模式[13]。
1.2 NF1基因的功能
NF1基因是抑癌基因，已知在多種惡性腫瘤中發生遺傳變異[14]。其編碼的神經纖維瘤蛋白由2 818個氨基酸組成，是一種在進化上高度保守的蛋白質，在細胞命運和功能的調控中發揮重要作用，且在機體多個組織和器官中均有表達[15]。神經纖維瘤蛋白有多個結構域，包括Ras-GTP酶激活蛋白相關結構域（GTPase-activating protein-related domain，GRD）、富含亮氨酸結構域（leucine-rich domain，LRD）、C末端結構域（C-terminal domain，CTD）和富含半胱氨酸-絲氨酸結構域（cysteine-serine rich domain，CSRD）[16-18]。其中，由NF1基因第21～27a外顯子編碼的GRD 是神經纖維瘤蛋白的主要功能域，也是被研究最多的結構域。它與GTP酶激活蛋白家族有同源性，能激活體內的Ras-GTP酶，催化與Ras結合的GTP水解，使Ras蛋白失活，因此是Ras信號轉導的負調節因子[19]。NF1基因突變將導致Ras及其多個下游通路過度激活，包括RAF-MEK-ERK（MAPK）通路、PI3K-Akt通路、RAL-GEF通路等[20]。其中，MAPK通路是最關鍵的下游通路之一，在多種NF1并發癥和腫瘤中表達上調[21-22]。LRD由Wang等[23]發現，其通過與含纈酪肽蛋白相互作用來調節樹突棘的形成，與NF1患者的認知功能障礙和癡呆表型相關[16]。CTD參與調節神經突起生長和樹突絲狀偽足形成，并通過與黏著斑激酶結合介導細胞黏附[24-25]。 CSRD位于神經纖維瘤蛋白的C末端，可被cAMP依賴的蛋白激酶A和蛋白激酶C磷酸化，而CSRD的蛋白激酶C磷酸化可調節神經纖維瘤蛋白的Ras-GTP酶活性[26]。
2 NF1基因突變
NF1基因是人類基因突變率最高的基因位點之一，自發突變率為1×10–4，約50%患者為新發突變[11，27]。NF1基因結構復雜，突變位點多變，貫穿于整個NF1基因，目前尚未發現真正的熱點突變區（圖1）。人類基因突變數據庫（
圖1
致病性NF1基因突變位點分布
Figure1.
Distribution of known pathogenic variants in the NF1 gene
NF1基因的不同突變位點與患者臨床表型之間的相關性尚未完全闡明。現已知影響第844～848密碼子的錯義突變與更嚴重的臨床表型有關，包括淺表pNF、癥狀性脊髓神經纖維瘤、視路膠質瘤（optic pathway glioma，OPG）、骨骼異常等，患者也面臨更高的腫瘤惡變風險[31]。此外，位于神經纖維瘤蛋白GRD的p.Arg1276或p.Lys1423的錯義突變也與更嚴重的表型有關，患者心血管畸形和骨骼異常風險明顯增加，p.Arg1276錯義突變的患者存在更高的癥狀性脊髓神經纖維瘤發生率[32]。NF1基因型-表型相關性研究總結見表1。
表1
NF1基因型-表型相關性研究
Table1.
Genotype-phenotype correlations reported in NF1
3 NF1轉基因療法
3.1 NF1轉基因治療的現狀
載體攜帶目的基因的精準靶向和高效遞送是轉基因治療成功的關鍵，目前研究常用載體分為病毒性載體和非病毒性載體兩大類。病毒性載體研究中應用最廣泛的是逆轉錄病毒載體，其外源性基因最大容量約為8.0 kb，適用于大部分目的基因，具有轉染效率高、外源基因整合到細胞基因組中、可長期表達而不產生有免疫原性的病毒蛋白等優點；但它只轉染至分裂期細胞，并且存在外源基因隨機插入細胞染色體中的風險[40]。腺病毒載體為雙鏈DNA病毒，轉染效率高，能夠轉染至分裂期和非分裂期細胞，但機體的免疫反應對其有清除作用，從而限制了應用[41]。腺相關病毒（adeno-associated virus，AAV）為單鏈DNA病毒，因無致病性、免疫原性低、轉染宿主范圍廣、轉染效率高等特點而被廣泛應用于體內基因治療[41-42]。已發現的AAV血清型有13種，每一種具有不同的組織趨向性，另外還可通過對AAV進行工程化改造產生重組AAV載體[42]。此外，病毒載體還包括單純皰疹病毒載體和慢病毒載體等。非病毒載體包括質粒、脂質體和納米顆粒等，具有安全、制備簡單以及外源基因載量大的優勢，但轉染效率相對較低。
雖然NF1 cDNA長度（8.5 kb）與NF1基因組DNA（350 kb）相比已顯著減小，但將整個NF1 cDNA裝載到單個AAV載體中仍有困難，為此研究者們往往采用保留基本功能的NF1基因截短片段。目前，一系列研究在神經纖維瘤蛋白缺陷的細胞中構建并表達了GRD基因片段，為NF1基因治療的可行性提供了有力證據。Hiatt等[43]利用逆轉錄病毒載體將編碼GRD的基因片段轉染至NF1–/– 原代造血細胞、肥大細胞和成纖維細胞中，發現這些細胞的異常增殖得到了抑制，Ras及其下游通路的過度激活也得到了逆轉。Thomas等[44]將編碼GRD的基因片段通過逆轉錄病毒載體轉染至神經纖維瘤蛋白缺陷的雪旺細胞中，發現細胞形態發生改變，Ras激活減少了16%～33%，細胞增殖減少了53%，但并不足以降低雪旺細胞的體外血管生成潛能。因此，他們推測神經纖維瘤蛋白的其他結構域可能參與調控血管生成因子表達的信號通路。Bodempudi等[45]在惡性周圍神經鞘瘤細胞系研究中也得到了類似結論，神經纖維瘤蛋白GRD的表達降低了細胞增殖和侵襲能力，改變了細胞周期進程，使細胞死亡增加。Bai等[46]通過多個AAV載體將編碼GRD的基因片段轉染至人雪旺細胞和惡性周圍神經鞘瘤細胞系，并比較其轉導效率，發現AAV-DJ是轉染效率較高的載體之一。在此基礎上，他們進一步構建了一個與H-Ras C端的10個氨基酸融合的GRD結構（GRD-C10），賦予其靶向質膜特性，結果表明與GRD相比，GRD-C10的表達更顯著地抑制了Ras通路和惡性周圍神經鞘瘤細胞的生長。這項研究提出能夠靶向質膜的GRD-C10在NF1和惡性周圍神經鞘瘤的基因治療中具有較大應用價值[46]。需要注意的是，表達神經纖維瘤蛋白GRD基因片段的轉基因療法存在一定局限性：① NF1基因突變并非高度集中于GRD區，而是分布于整個NF1基因；② 在沒有其他結構域協同作用情況下，單獨表達GRD可能并不足以逆轉神經纖維瘤蛋白功能喪失[47]。因此，在上述兩方面仍需更多的體內外實驗深入驗證。
近年來，Fadhlullah等[28]的一項研究應用shRNA介導NF1基因敲低的小鼠構建轉基因治療模型，首次在體內驗證了轉基因療法對NF1相關腫瘤的治療效果。通過質粒載體在NF1–/–人腦膠質瘤細胞中分別過表達神經纖維瘤蛋白的4個主要結構域，即CSRD、GRD、LRD和CTD，初步細胞實驗結果顯示LRD過表達顯著抑制了人腦膠質瘤細胞的侵襲且不影響其增殖，并且這種抑制作用不依賴于Ras信號。為了評估腫瘤在體內的侵襲性，研究者進一步將LRD基因片段轉導至NF1敲低的小鼠膠質瘤增殖細胞中，發現與僅轉導載體的對照組相比，LRD表達的腫瘤中腫瘤組織與正常組織之間存在明顯分界，且侵襲細胞數量顯著降低，LRD轉導的6只小鼠中有5只表現出非侵襲性、高度局限性的腫瘤[28]。這項研究不僅揭示了神經纖維瘤蛋白LRD在膠質瘤生物學中的重要功能，也給NF1轉基因治療的有效性提供了更有力證據。
3.2 NF1轉基因治療的前景
目前，影響NF1轉基因療法臨床應用的主要問題是NF1 cDNA過大而無法被裝載到單個AAV載體中。針對該問題，研究者們提出的第1個對策是拆分載體遞送系統，將較大的cDNA進行拆分，分別由2個或3個AAV載體攜帶并向靶細胞傳遞，然后在細胞內重組整個大基因表達框，表達完整蛋白[48]。這種策略將AAV載體的外源基因載量擴大到約9 kb（雙AAV載體）或14 kb（三AAV載體），已經被成功應用于多種組織表達全長蛋白，如視網膜、內耳、肌肉和肝臟等[49-53]。例如， Akil等[49]以及Al-Moyed等[50]采用雙AAV載體遞送方法成功地將6 kb全長otoferlin cDNA遞送到otoferlin敲除的小鼠內毛細胞中，并恢復了全聾小鼠聽力。針對重組機制進行優化設計、提高重組效率是未來發展方向之一，其目標是使用較低劑量的AAV載體完成高效率轉導，并且使目的蛋白表達提高到治療水平。
第2個對策是增加單一載體運載量。例如，Grieger等[54]的研究表明，缺乏Vp2衣殼蛋白的AAV載體運載能力提高到6 kb，同時使用蛋白酶體抑制劑，有利于阻斷裝載有較大基因的重組AAV被蛋白酶體降解。在另一項研究中，采用人博卡病毒1型的衣殼蛋白重組AAV成功裝載了全長CFTR基因，且在極化的人氣道上皮細胞中轉導效率顯著提高[55]。最后，開發新遞送系統用于靶向遞送全長NF1 cDNA也是一種具有前景的替代方案。
4 NF1基因編輯策略
4.1 基因組編輯技術概述
基因組編輯技術是一種新興的對生物體基因組特定目標基因加以修飾的基因工程技術，其中新一代成簇的規律間隔的短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）/CRISPR相關蛋白9（CRISPR-associated protein 9，Cas9）技術操作簡單，經優化后可在真核細胞中實現高度靈活且特異的基因組編輯，正逐漸成為基因編輯最有力工具[56]。針對靶DNA序列的錯誤堿基片段，CRISPR/Cas9系統能夠通過sgRNA對其保守的前間隔序列鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM）的識別、Cas9蛋白與PAM的結合，引導定點切割，產生DNA雙鏈斷裂（double-strand break，DSB）。切割后形成的DSB通過兩種途徑修復：非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）和同源重組修復（homology-directed repair，HDR）[57]。NHEJ不需要同源模板，直接將斷裂的DNA雙鏈末端重新連接；HDR則可通過外源DNA“供體模板”修復斷裂雙鏈，從而實現精準修飾[57]。真核細胞未經干預情況下，占據主導地位的往往是NHEJ，故斷裂DNA直接拼接過程常導致小片段DNA插入或缺失[57]。因此，在CRISPR/Cas9基礎上，研究者又開發出堿基編輯和先導編輯技術。2016年，Komor等[58]首次報道的堿基編輯器是將Cas9與胞嘧啶脫氨酶融合，在不切斷DNA雙鏈情況下精確引入由C/G堿基到T/A堿基的轉換，即胞嘧啶堿基編輯器（cytosine base editor，CBE）。此后，介導A/T堿基到G/C堿基轉換的腺嘌呤堿基編輯器（adenine base editor，ABE）也被開發出來。近年來，多個實驗室也陸續發表了類似的堿基編輯器，并對這些工具進行了改進和優化，以實現更加高效、精準的堿基編輯。例如，李大力教授團隊開發的雙功能高活性堿基編輯器A&C-BEmax以及腺嘌呤顛換編輯器ACBEs等[59-61]，顯著提高了堿基編輯效率，并擴大了其適用范圍。先導編輯則是將CRISPR與逆轉錄酶結合，可在無需DSB或供體DNA模板情況下，對目標基因實現靶向性微小插入、微小缺失以及任意堿基轉換和顛換，它的適用范圍更廣，為治療復雜人類遺傳疾病提供了有效工具[62-63]。目前，這些新一代基因編輯工具已經在鐮狀細胞病[64-66]、β-地中海貧血[64-65，67]、脊髓性肌萎縮癥[68]和Leber先天性黑朦癥[69]等遺傳性疾病治療中進行了初步嘗試，并取得了可喜成果。
4.2 CRISPR基因編輯工具糾正NF1基因致病性突變的可行性
最近一項研究發現，NF1基因第17號外顯子缺失對神經纖維瘤蛋白表達和GRD活性影響很小，利用反義磷酸二酰胺嗎啉代寡聚物在攜帶致病性突變c.1885G>A 和c.1929delG的人類細胞系中跳過第17號外顯子，能恢復功能性神經纖維瘤蛋白的表達[70]。因此，理論上對于NF1基因第17號外顯子上的致病性突變，CRISPR/Cas9基因編輯系統可通過靶向切除該外顯子，達到恢復神經纖維瘤蛋白功能的目的。
若有合適的PAM識別位點和堿基編輯窗口，與NF1嚴重表型相關的影響第844～848密碼子的錯義突變c.2530C>T、c.2534G>A、c.2542G>A、c.2543G>A，以及p.Arg1276的錯義突變c.3827G>A，都可通過ABEs介導A堿基到G堿基的轉換來糾正；影響第844～848密碼子錯義突變c.2531T>C、c.2533T>C、c.2540T>C，以及p.Lys1423的錯義突變c.4267A>G，都可通過CBEs介導C堿基到T堿基的轉換來糾正[31-32]。需要注意的是，與CRISPR/Cas9相比，堿基編輯不能介導靶向性插入或缺失，并且在應用相應的堿基編輯器時，可能導致旁觀者編輯和脫靶效應。同時，如何進一步提高編輯效率也是堿基編輯的一大難題。
與CRISPR/Cas9和堿基編輯相比，先導編輯不僅能實現所有12種可能的堿基替換，還可實現小片段的插入與刪除，并且受PAM位點的限制較小[63]。因此，先導編輯的適用范圍大大拓寬，原則上可以修復89%的已知致病性人類遺傳變異[68]。NF1基因的大部分致病性突變都有望用先導編輯糾正，但先導編輯器的體內遞送和編輯效率等尚待改進。
應用新一代基因編輯工具治療NF1，還需要具備高效的遞送系統，與此同時安全性和相關的倫理問題也不容忽視。
5 NF1基因治療的時機與意義
pNF可引起容貌畸形和嚴重功能障礙，有惡變傾向，甚至危及生命，給患者帶來了沉重的疾病負擔，是NF1基因治療的主要目標和關鍵所在。它是一種包含多種細胞類型的異質性腫瘤[71]，雪旺細胞是其中的主要細胞群，因其表現出異常的侵襲和血管生成特性，很早就被認為是pNF最可能的起源細胞[72]。在胚胎發育過程中，雪旺細胞由神經嵴細胞經由雪旺前體細胞分化而來[73]。近年研究發現，人和小鼠的pNF中NF1基因功能喪失發生在雪旺細胞中；隨后，NF1小鼠模型揭示了在神經發育早期的雪旺細胞譜系中NF1雙等位基因失活會啟動pNF的形成，雪旺細胞譜系發育不同階段的細胞類型均具有形成腫瘤的潛力[73-76]。
盡管胚胎時期和出生后早期的發育階段為基因治療關鍵時期，理論上在此階段恢復NF1基因功能有望從根本上阻斷腫瘤發生，但相關倫理問題和潛在隱患不可忽視。然而，臨床面臨的難題往往是如何阻止或延緩患者pNF進展。傳統手術切除或藥物治療難以徹底根治pNF且存在復發問題，故在pNF瘤體形成之后基因治療仍有其重要意義。基因治療是一種根本性治療策略，其優勢在于從基因層面進行替代或“修復”，從而恢復神經纖維瘤蛋白功能，能夠有效抑制瘤體生長、擴散和進展，在控制病情同時降低神經纖維瘤惡變和復發風險，恢復患者容貌和功能。一旦成功取代或糾正了患者致病基因，治療效果可能會持續多年，甚至終身，因此能夠大幅改善患者生活質量并延長生存時間。但必須指出的是，NF1基因治療策略及其可行性、有效性和安全性等問題尚未完全明確，需要進一步研究數據支持，帶來的諸多社會、法律、監管方面的挑戰也亟待解決。
6 小結與展望
NF1是由NF1基因突變引起的單基因遺傳病，目前治療手段有限，其基因治療策略仍處于研究和開發階段。一系列研究在神經纖維瘤蛋白缺陷的細胞中構建并表達了GRD基因片段，證明了NF1轉基因療法的可行性；未來的研究方向主要在于使用拆分載體遞送系統，增加單一載體運載量，以及開發新的遞送系統用于靶向遞送全長NF1 cDNA。CRISPR/Cas9、堿基編輯、先導編輯等新一代基因編輯工具，在治療NF1這類單基因遺傳病方面的潛力和優勢已經日益顯現，但仍然需要進一步優化，以提高其效率并確保安全性。隨著NF1致病機制的揭示、神經纖維瘤蛋白功能的完整闡釋和遞送載體的不斷優化，NF1的基因治療策略也會日趨完善，為NF1患者提供精準化治療，以減緩疾病進展、改善功能和提高生存質量，最終實現NF1治療領域的巨大突破。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點及其報道
作者貢獻聲明 鄭婷婷：綜述構思及設計、文章撰寫；朱倍瑤：文獻資料收集及整理；王智超：提出綜述撰寫方向及綜述修改意見；李青峰：綜述修改及審校
Ⅰ型神經纖維瘤病（neurofibromatosis type 1，NF1）又稱Von Recklinghausen病，是由NF1基因突變引起的常染色體顯性遺傳性疾病，據統計全球新生兒發病率約為1/3 000[1-2]，其中約50%為散發型突變。患者多幼年起病，臨床表現多樣，如咖啡牛奶斑、腋窩或腹股溝淡褐色雀斑和多發性神經纖維瘤，同時往往存在多系統受累，包括并發多種良、惡性腫瘤，骨骼發育異常，心腦血管疾病，認知和心理異常等[3-6]。神經纖維瘤是NF1特征性癥狀之一，分為皮膚型神經纖維瘤（cutaneous neurofibroma，cNF）和叢狀神經纖維瘤（plexiform neurofibroma，pNF）。其中，pNF多呈浸潤性生長，破壞周圍正常組織和器官，8%～13% pNF會轉為惡性周圍神經鞘瘤[7-9]。目前，NF1主要以手術、藥物等對癥治療為主，雖能緩解癥狀，但不能根治疾病。
基因治療是一種新興技術，主要包括轉基因和基因編輯兩大技術路徑，目前已經在單基因遺傳病治療中顯示出了巨大應用潛力。由于NF1是單基因功能喪失所致，因此可以通過傳遞轉基因取代或糾正有缺陷基因，從而達到治療目的。現就NF1的基因治療研究進展及前景作一綜述，以期為后續研究提供參考。
1 NF1基因的結構與功能
1.1 NF1基因的結構
NF1基因是人類基因組中最大的基因之一，定位于17q11.2，全長350 kb，由61個外顯子組成，編碼一段長11～13 kb的mRNA[10-11]。其中最大的27號內含子包含了外翻病毒插入部位基因（entropic viral insertion site gene，EVI）的2個亞型EVI2A、EVI2B以及少突神經膠質細胞髓磷脂糖蛋白等3個鑲嵌基因[12]。這些鑲嵌基因的功能尚不清楚，可能對NF1的臨床表型有一定影響。此外，NF1基因有4種剪接變體，呈現發育時期和組織特異性表達模式[13]。
1.2 NF1基因的功能
NF1基因是抑癌基因，已知在多種惡性腫瘤中發生遺傳變異[14]。其編碼的神經纖維瘤蛋白由2 818個氨基酸組成，是一種在進化上高度保守的蛋白質，在細胞命運和功能的調控中發揮重要作用，且在機體多個組織和器官中均有表達[15]。神經纖維瘤蛋白有多個結構域，包括Ras-GTP酶激活蛋白相關結構域（GTPase-activating protein-related domain，GRD）、富含亮氨酸結構域（leucine-rich domain，LRD）、C末端結構域（C-terminal domain，CTD）和富含半胱氨酸-絲氨酸結構域（cysteine-serine rich domain，CSRD）[16-18]。其中，由NF1基因第21～27a外顯子編碼的GRD 是神經纖維瘤蛋白的主要功能域，也是被研究最多的結構域。它與GTP酶激活蛋白家族有同源性，能激活體內的Ras-GTP酶，催化與Ras結合的GTP水解，使Ras蛋白失活，因此是Ras信號轉導的負調節因子[19]。NF1基因突變將導致Ras及其多個下游通路過度激活，包括RAF-MEK-ERK（MAPK）通路、PI3K-Akt通路、RAL-GEF通路等[20]。其中，MAPK通路是最關鍵的下游通路之一，在多種NF1并發癥和腫瘤中表達上調[21-22]。LRD由Wang等[23]發現，其通過與含纈酪肽蛋白相互作用來調節樹突棘的形成，與NF1患者的認知功能障礙和癡呆表型相關[16]。CTD參與調節神經突起生長和樹突絲狀偽足形成，并通過與黏著斑激酶結合介導細胞黏附[24-25]。 CSRD位于神經纖維瘤蛋白的C末端，可被cAMP依賴的蛋白激酶A和蛋白激酶C磷酸化，而CSRD的蛋白激酶C磷酸化可調節神經纖維瘤蛋白的Ras-GTP酶活性[26]。
2 NF1基因突變
NF1基因是人類基因突變率最高的基因位點之一，自發突變率為1×10–4，約50%患者為新發突變[11，27]。NF1基因結構復雜，突變位點多變，貫穿于整個NF1基因，目前尚未發現真正的熱點突變區（圖1）。人類基因突變數據庫（
圖1
致病性NF1基因突變位點分布
Figure1.
Distribution of known pathogenic variants in the NF1 gene
NF1基因的不同突變位點與患者臨床表型之間的相關性尚未完全闡明。現已知影響第844～848密碼子的錯義突變與更嚴重的臨床表型有關，包括淺表pNF、癥狀性脊髓神經纖維瘤、視路膠質瘤（optic pathway glioma，OPG）、骨骼異常等，患者也面臨更高的腫瘤惡變風險[31]。此外，位于神經纖維瘤蛋白GRD的p.Arg1276或p.Lys1423的錯義突變也與更嚴重的表型有關，患者心血管畸形和骨骼異常風險明顯增加，p.Arg1276錯義突變的患者存在更高的癥狀性脊髓神經纖維瘤發生率[32]。NF1基因型-表型相關性研究總結見表1。
表1
NF1基因型-表型相關性研究
Table1.
Genotype-phenotype correlations reported in NF1
3 NF1轉基因療法
3.1 NF1轉基因治療的現狀
載體攜帶目的基因的精準靶向和高效遞送是轉基因治療成功的關鍵，目前研究常用載體分為病毒性載體和非病毒性載體兩大類。病毒性載體研究中應用最廣泛的是逆轉錄病毒載體，其外源性基因最大容量約為8.0 kb，適用于大部分目的基因，具有轉染效率高、外源基因整合到細胞基因組中、可長期表達而不產生有免疫原性的病毒蛋白等優點；但它只轉染至分裂期細胞，并且存在外源基因隨機插入細胞染色體中的風險[40]。腺病毒載體為雙鏈DNA病毒，轉染效率高，能夠轉染至分裂期和非分裂期細胞，但機體的免疫反應對其有清除作用，從而限制了應用[41]。腺相關病毒（adeno-associated virus，AAV）為單鏈DNA病毒，因無致病性、免疫原性低、轉染宿主范圍廣、轉染效率高等特點而被廣泛應用于體內基因治療[41-42]。已發現的AAV血清型有13種，每一種具有不同的組織趨向性，另外還可通過對AAV進行工程化改造產生重組AAV載體[42]。此外，病毒載體還包括單純皰疹病毒載體和慢病毒載體等。非病毒載體包括質粒、脂質體和納米顆粒等，具有安全、制備簡單以及外源基因載量大的優勢，但轉染效率相對較低。
雖然NF1 cDNA長度（8.5 kb）與NF1基因組DNA（350 kb）相比已顯著減小，但將整個NF1 cDNA裝載到單個AAV載體中仍有困難，為此研究者們往往采用保留基本功能的NF1基因截短片段。目前，一系列研究在神經纖維瘤蛋白缺陷的細胞中構建并表達了GRD基因片段，為NF1基因治療的可行性提供了有力證據。Hiatt等[43]利用逆轉錄病毒載體將編碼GRD的基因片段轉染至NF1–/– 原代造血細胞、肥大細胞和成纖維細胞中，發現這些細胞的異常增殖得到了抑制，Ras及其下游通路的過度激活也得到了逆轉。Thomas等[44]將編碼GRD的基因片段通過逆轉錄病毒載體轉染至神經纖維瘤蛋白缺陷的雪旺細胞中，發現細胞形態發生改變，Ras激活減少了16%～33%，細胞增殖減少了53%，但并不足以降低雪旺細胞的體外血管生成潛能。因此，他們推測神經纖維瘤蛋白的其他結構域可能參與調控血管生成因子表達的信號通路。Bodempudi等[45]在惡性周圍神經鞘瘤細胞系研究中也得到了類似結論，神經纖維瘤蛋白GRD的表達降低了細胞增殖和侵襲能力，改變了細胞周期進程，使細胞死亡增加。Bai等[46]通過多個AAV載體將編碼GRD的基因片段轉染至人雪旺細胞和惡性周圍神經鞘瘤細胞系，并比較其轉導效率，發現AAV-DJ是轉染效率較高的載體之一。在此基礎上，他們進一步構建了一個與H-Ras C端的10個氨基酸融合的GRD結構（GRD-C10），賦予其靶向質膜特性，結果表明與GRD相比，GRD-C10的表達更顯著地抑制了Ras通路和惡性周圍神經鞘瘤細胞的生長。這項研究提出能夠靶向質膜的GRD-C10在NF1和惡性周圍神經鞘瘤的基因治療中具有較大應用價值[46]。需要注意的是，表達神經纖維瘤蛋白GRD基因片段的轉基因療法存在一定局限性：① NF1基因突變并非高度集中于GRD區，而是分布于整個NF1基因；② 在沒有其他結構域協同作用情況下，單獨表達GRD可能并不足以逆轉神經纖維瘤蛋白功能喪失[47]。因此，在上述兩方面仍需更多的體內外實驗深入驗證。
近年來，Fadhlullah等[28]的一項研究應用shRNA介導NF1基因敲低的小鼠構建轉基因治療模型，首次在體內驗證了轉基因療法對NF1相關腫瘤的治療效果。通過質粒載體在NF1–/–人腦膠質瘤細胞中分別過表達神經纖維瘤蛋白的4個主要結構域，即CSRD、GRD、LRD和CTD，初步細胞實驗結果顯示LRD過表達顯著抑制了人腦膠質瘤細胞的侵襲且不影響其增殖，并且這種抑制作用不依賴于Ras信號。為了評估腫瘤在體內的侵襲性，研究者進一步將LRD基因片段轉導至NF1敲低的小鼠膠質瘤增殖細胞中，發現與僅轉導載體的對照組相比，LRD表達的腫瘤中腫瘤組織與正常組織之間存在明顯分界，且侵襲細胞數量顯著降低，LRD轉導的6只小鼠中有5只表現出非侵襲性、高度局限性的腫瘤[28]。這項研究不僅揭示了神經纖維瘤蛋白LRD在膠質瘤生物學中的重要功能，也給NF1轉基因治療的有效性提供了更有力證據。
3.2 NF1轉基因治療的前景
目前，影響NF1轉基因療法臨床應用的主要問題是NF1 cDNA過大而無法被裝載到單個AAV載體中。針對該問題，研究者們提出的第1個對策是拆分載體遞送系統，將較大的cDNA進行拆分，分別由2個或3個AAV載體攜帶并向靶細胞傳遞，然后在細胞內重組整個大基因表達框，表達完整蛋白[48]。這種策略將AAV載體的外源基因載量擴大到約9 kb（雙AAV載體）或14 kb（三AAV載體），已經被成功應用于多種組織表達全長蛋白，如視網膜、內耳、肌肉和肝臟等[49-53]。例如， Akil等[49]以及Al-Moyed等[50]采用雙AAV載體遞送方法成功地將6 kb全長otoferlin cDNA遞送到otoferlin敲除的小鼠內毛細胞中，并恢復了全聾小鼠聽力。針對重組機制進行優化設計、提高重組效率是未來發展方向之一，其目標是使用較低劑量的AAV載體完成高效率轉導，并且使目的蛋白表達提高到治療水平。
第2個對策是增加單一載體運載量。例如，Grieger等[54]的研究表明，缺乏Vp2衣殼蛋白的AAV載體運載能力提高到6 kb，同時使用蛋白酶體抑制劑，有利于阻斷裝載有較大基因的重組AAV被蛋白酶體降解。在另一項研究中，采用人博卡病毒1型的衣殼蛋白重組AAV成功裝載了全長CFTR基因，且在極化的人氣道上皮細胞中轉導效率顯著提高[55]。最后，開發新遞送系統用于靶向遞送全長NF1 cDNA也是一種具有前景的替代方案。
4 NF1基因編輯策略
4.1 基因組編輯技術概述
基因組編輯技術是一種新興的對生物體基因組特定目標基因加以修飾的基因工程技術，其中新一代成簇的規律間隔的短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）/CRISPR相關蛋白9（CRISPR-associated protein 9，Cas9）技術操作簡單，經優化后可在真核細胞中實現高度靈活且特異的基因組編輯，正逐漸成為基因編輯最有力工具[56]。針對靶DNA序列的錯誤堿基片段，CRISPR/Cas9系統能夠通過sgRNA對其保守的前間隔序列鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM）的識別、Cas9蛋白與PAM的結合，引導定點切割，產生DNA雙鏈斷裂（double-strand break，DSB）。切割后形成的DSB通過兩種途徑修復：非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）和同源重組修復（homology-directed repair，HDR）[57]。NHEJ不需要同源模板，直接將斷裂的DNA雙鏈末端重新連接；HDR則可通過外源DNA“供體模板”修復斷裂雙鏈，從而實現精準修飾[57]。真核細胞未經干預情況下，占據主導地位的往往是NHEJ，故斷裂DNA直接拼接過程常導致小片段DNA插入或缺失[57]。因此，在CRISPR/Cas9基礎上，研究者又開發出堿基編輯和先導編輯技術。2016年，Komor等[58]首次報道的堿基編輯器是將Cas9與胞嘧啶脫氨酶融合，在不切斷DNA雙鏈情況下精確引入由C/G堿基到T/A堿基的轉換，即胞嘧啶堿基編輯器（cytosine base editor，CBE）。此后，介導A/T堿基到G/C堿基轉換的腺嘌呤堿基編輯器（adenine base editor，ABE）也被開發出來。近年來，多個實驗室也陸續發表了類似的堿基編輯器，并對這些工具進行了改進和優化，以實現更加高效、精準的堿基編輯。例如，李大力教授團隊開發的雙功能高活性堿基編輯器A&C-BEmax以及腺嘌呤顛換編輯器ACBEs等[59-61]，顯著提高了堿基編輯效率，并擴大了其適用范圍。先導編輯則是將CRISPR與逆轉錄酶結合，可在無需DSB或供體DNA模板情況下，對目標基因實現靶向性微小插入、微小缺失以及任意堿基轉換和顛換，它的適用范圍更廣，為治療復雜人類遺傳疾病提供了有效工具[62-63]。目前，這些新一代基因編輯工具已經在鐮狀細胞病[64-66]、β-地中海貧血[64-65，67]、脊髓性肌萎縮癥[68]和Leber先天性黑朦癥[69]等遺傳性疾病治療中進行了初步嘗試，并取得了可喜成果。
4.2 CRISPR基因編輯工具糾正NF1基因致病性突變的可行性
最近一項研究發現，NF1基因第17號外顯子缺失對神經纖維瘤蛋白表達和GRD活性影響很小，利用反義磷酸二酰胺嗎啉代寡聚物在攜帶致病性突變c.1885G>A 和c.1929delG的人類細胞系中跳過第17號外顯子，能恢復功能性神經纖維瘤蛋白的表達[70]。因此，理論上對于NF1基因第17號外顯子上的致病性突變，CRISPR/Cas9基因編輯系統可通過靶向切除該外顯子，達到恢復神經纖維瘤蛋白功能的目的。
若有合適的PAM識別位點和堿基編輯窗口，與NF1嚴重表型相關的影響第844～848密碼子的錯義突變c.2530C>T、c.2534G>A、c.2542G>A、c.2543G>A，以及p.Arg1276的錯義突變c.3827G>A，都可通過ABEs介導A堿基到G堿基的轉換來糾正；影響第844～848密碼子錯義突變c.2531T>C、c.2533T>C、c.2540T>C，以及p.Lys1423的錯義突變c.4267A>G，都可通過CBEs介導C堿基到T堿基的轉換來糾正[31-32]。需要注意的是，與CRISPR/Cas9相比，堿基編輯不能介導靶向性插入或缺失，并且在應用相應的堿基編輯器時，可能導致旁觀者編輯和脫靶效應。同時，如何進一步提高編輯效率也是堿基編輯的一大難題。
與CRISPR/Cas9和堿基編輯相比，先導編輯不僅能實現所有12種可能的堿基替換，還可實現小片段的插入與刪除，并且受PAM位點的限制較小[63]。因此，先導編輯的適用范圍大大拓寬，原則上可以修復89%的已知致病性人類遺傳變異[68]。NF1基因的大部分致病性突變都有望用先導編輯糾正，但先導編輯器的體內遞送和編輯效率等尚待改進。
應用新一代基因編輯工具治療NF1，還需要具備高效的遞送系統，與此同時安全性和相關的倫理問題也不容忽視。
5 NF1基因治療的時機與意義
pNF可引起容貌畸形和嚴重功能障礙，有惡變傾向，甚至危及生命，給患者帶來了沉重的疾病負擔，是NF1基因治療的主要目標和關鍵所在。它是一種包含多種細胞類型的異質性腫瘤[71]，雪旺細胞是其中的主要細胞群，因其表現出異常的侵襲和血管生成特性，很早就被認為是pNF最可能的起源細胞[72]。在胚胎發育過程中，雪旺細胞由神經嵴細胞經由雪旺前體細胞分化而來[73]。近年研究發現，人和小鼠的pNF中NF1基因功能喪失發生在雪旺細胞中；隨后，NF1小鼠模型揭示了在神經發育早期的雪旺細胞譜系中NF1雙等位基因失活會啟動pNF的形成，雪旺細胞譜系發育不同階段的細胞類型均具有形成腫瘤的潛力[73-76]。
盡管胚胎時期和出生后早期的發育階段為基因治療關鍵時期，理論上在此階段恢復NF1基因功能有望從根本上阻斷腫瘤發生，但相關倫理問題和潛在隱患不可忽視。然而，臨床面臨的難題往往是如何阻止或延緩患者pNF進展。傳統手術切除或藥物治療難以徹底根治pNF且存在復發問題，故在pNF瘤體形成之后基因治療仍有其重要意義。基因治療是一種根本性治療策略，其優勢在于從基因層面進行替代或“修復”，從而恢復神經纖維瘤蛋白功能，能夠有效抑制瘤體生長、擴散和進展，在控制病情同時降低神經纖維瘤惡變和復發風險，恢復患者容貌和功能。一旦成功取代或糾正了患者致病基因，治療效果可能會持續多年，甚至終身，因此能夠大幅改善患者生活質量并延長生存時間。但必須指出的是，NF1基因治療策略及其可行性、有效性和安全性等問題尚未完全明確，需要進一步研究數據支持，帶來的諸多社會、法律、監管方面的挑戰也亟待解決。
6 小結與展望
NF1是由NF1基因突變引起的單基因遺傳病，目前治療手段有限，其基因治療策略仍處于研究和開發階段。一系列研究在神經纖維瘤蛋白缺陷的細胞中構建并表達了GRD基因片段，證明了NF1轉基因療法的可行性；未來的研究方向主要在于使用拆分載體遞送系統，增加單一載體運載量，以及開發新的遞送系統用于靶向遞送全長NF1 cDNA。CRISPR/Cas9、堿基編輯、先導編輯等新一代基因編輯工具，在治療NF1這類單基因遺傳病方面的潛力和優勢已經日益顯現，但仍然需要進一步優化，以提高其效率并確保安全性。隨著NF1致病機制的揭示、神經纖維瘤蛋白功能的完整闡釋和遞送載體的不斷優化，NF1的基因治療策略也會日趨完善，為NF1患者提供精準化治療，以減緩疾病進展、改善功能和提高生存質量，最終實現NF1治療領域的巨大突破。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點及其報道
作者貢獻聲明 鄭婷婷：綜述構思及設計、文章撰寫；朱倍瑤：文獻資料收集及整理；王智超：提出綜述撰寫方向及綜述修改意見；李青峰：綜述修改及審校
