引用本文： 李懷任, 韓鳳平, 孟靜, 常文利, 馮立. 創傷性腦損傷促進骨折愈合機制研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2024, 38(1): 125-132. doi: 10.7507/1002-1892.202310045 復制
骨折不愈合或延遲愈合發生率達5%～10%，其治療對于創傷外科醫生是一重大挑戰[1]，如何降低骨折不愈合發生率是亟待解決的問題。創傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）與骨折愈合關系密切，20世紀60年代Calandriello[2]發現重型顱腦損傷合并骨折患者與單純骨折患者相比會形成更多骨痂組織；此后關于TBI與骨折愈合關系的研究越來越多，TBI促進骨折愈合的觀點逐漸被學界認同。研究者們設想通過探索TBI促進骨折愈合機制，找到治療骨折不愈合新靶點。研究發現TBI常伴隨補體、趨化因子和炎癥遞質的釋放，從而促進炎癥反應發生[3]，同時血腦屏障完整性被破壞，導致腦脊液中小分子物質入血，通過蛋白組學檢測發現TBI合并骨折患者血清中多種物質含量與單純骨折患者存在明顯差異[4]，這些因素對骨折愈合有密切影響。然而，TBI促進骨折愈合的病理生理過程仍未完全闡明。本文擬從體液、神經及免疫3個方面對TBI加速骨折愈合的作用機制研究進展進行綜述，為骨折不愈合的臨床治療提供依據。
1 體液因素
大量臨床前和臨床試驗證明TBI后的血腦屏障通透性增加，中樞神經系統合成，釋放的小分子物質通過血腦屏障滲漏到外周循環中，導致體液中各種成骨因子濃度增加[5]。其中包括神經系統為修復自身損傷而分泌的促血管再生因子（如VEGF、BMP-2等），促進組織修復的FGF-2、TGF-β1等；以及神經系統在TBI后，一部分維持正常生理功能的激素表達增強，如瘦素、褪黑素等。另外，有研究表明使用TBI患者的血清培養MSCs，可以加速MSCs成骨分化，進一步提示TBI加速骨愈合可能涉及全身體液因素[3]。
1.1 細胞因子
1.1.1 VEGF
VEGF是血管內皮細胞的特異性有絲分裂原，不僅參與血管生成，在軟骨內骨化和膜內骨化過程中均起一定作用，還參與骨骼發育的各個方面，包括軟骨細胞分化、成骨細胞分化和破骨細胞募集[6]。VEGF是血管生成過程中不可或缺的因素，VEGF依賴性血管侵犯是軟骨吸收與骨形成相結合的必要條件[7]。另外，VEGF參與調節成骨細胞和脂肪細胞分化之間的平衡，通過調節轉錄因子Runt相關轉錄因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）和過氧化物酶體增殖物激活受體γ2（PPARγ2），以及通過與核包膜蛋白層粘連蛋白A/C的相互作用來控制MSCs的分化[8-9]。
TBI通常繼發病理性損傷引起腦缺血、缺氧，從而上調缺氧誘導因子的表達，最終腦組織VEGF表達升高[10-11]。VEGF通過受損的血腦屏障進入體液循環，誘導血管生成和成骨細胞增殖分化，從而促進骨折愈合和新骨形成[12]。李繼慶等[13]發現骨折合并TBI患者血清中的VEGF濃度明顯高于單純骨折組，且骨折愈合更快。既往研究表明，VEGF對于成骨細胞具有趨化作用，對骨的形成與重建有重要作用[14]。Zhang 等[15]發現鎖骨骨折合并TBI患者血清中VEGF濃度較單純鎖骨骨折患者更高，鎖骨愈合更快。因此，TBI可能通過上調VEGF的表達來加速骨折愈合。
1.1.2 TGF-β1
TGF-β1 是一種主要存在于骨基質中的多肽分子，可調節骨細胞增殖與分化，促進新骨形成，并在一定條件下抑制骨吸收，是骨組織修復和再生中的重要調節因子[16]。Xia等[17]發現在小鼠骨折愈合過程中，骨膜細胞TGF-β1/Smad2信號持續被激活，并且TGF-β1可誘導骨膜細胞早期分化為軟骨細胞，軟骨細胞進一步分化為成骨細胞，從而促進小鼠骨折愈合。使用TGF-β1抑制劑可導致骨折小鼠軟骨內骨形成延遲和受損[17]。因此，TGF-β1信號通過調節骨膜細胞的軟骨形成過程，在骨折愈合修復中起著至關重要的作用。馬維等[18]研究發現當TBI和骨折同時發生時，骨折合并TBI大鼠血清中 TGF-β1 的表達強于單純骨折大鼠，因為TGF-β1通過受損的血腦屏障進入全身循環，進一步促進骨生長和修復，表明TBI導致血清中TGF-β1增加對骨愈合和生長具有重要作用。
1.1.3 BMP-2
作為TGF-β超家族的重要成員，BMP是一種非常強大的細胞因子，控制著大量生物過程，包括腎臟發育、手指和肢體形成、血管生成、組織纖維化和腫瘤發育等[19]。BMP可以誘導骨骼和軟骨形成，刺激成骨細胞和軟骨細胞分化。在骨骼和軟骨發育過程中，BMP通過激活Smad信號來調節幾種轉錄因子的表達和功能[20-21]。遺傳研究表明，Runx2、成骨細胞特異性轉錄因子（Osterix）和Y染色體性別決定區盒轉錄因子9（Sox9）均在BMP下游發揮作用，在骨骼及軟骨發育中起著至關重要的作用[22-24]。另外，BMP還可以上調PDGF、VEGF和IGF-1等生長因子的表達，參與MSCs的早期募集，在整個成骨和成軟骨分化過程中持續存在，直到形成編織骨[25-26]。郭啟等[27]研究發現，骨折合并TBI組比單純骨折組表達更多BMP-2。BMP-2作為成骨細胞和軟骨細胞表型的主要分化觸發因素，通過激活Smad1/5/8 信號通路驅動骨形成導致骨和軟骨形成，在TBI促進骨折愈合機制中扮演重要角色。
1.1.4 FGF-2
FGF-2屬于FGF家族，在人體內發揮組織穩態、修復、再生、血管生成和骨代謝的重要作用[28-29]。FGF-2可以激活多種絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路，誘導細胞有絲分裂、炎癥反應和應激反應，參與細胞周期、細胞骨架形成和細胞遷移[30]。FGF-2通過磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）-蛋白激酶B （AKT）通路調節MSCs遷移[31]，通過激活細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）1/2途徑促進BMSCs增殖、成骨細胞增殖和分化，在成骨細胞和軟骨細胞分化過程中起著非常重要的作用[32-33]。FGF-2除了參與骨骼發育、骨形成和骨折修復，還在血管生成中具有關鍵作用。其可刺激血管生長，與VEGF、PDGF具有協同作用[28]。Mollahosseini等[34]研究表明股骨骨折合并TBI組患者血清中FGF-2和 PDGF 水平明顯高于其他組，并且與單純股骨骨折患者相比，骨折合并TBI組的股骨骨折愈合時間更短。
1.2 激素
1.2.1 瘦素
早期研究發現，瘦素是一種由脂肪組織分泌的激素，通過負反饋機制調控生物體的能量平衡以及體質量。目前研究發現，瘦素是一種多效性激素，參與調節多個器官系統的功能穩態，如胰島素穩態、生殖、免疫功能和大腦發育[35]。瘦素也被證明是調節骨代謝的重要因素，并提出了一種雙重機制（中樞和外周），其中瘦素通過中樞神經系統減少骨骼生長，同時在外周作為骨生長的促進劑，通過中樞神經系統調節生長激素分泌的代謝信號[36-37]。Yan等[38]探討了瘦素與TBI之間的關系，發現TBI后血清和腦脊液中的瘦素水平顯著升高；Graef等[39]發現瘦素缺乏小鼠骨折愈合較野生型小鼠減慢，而且TBI加速骨折愈合的機制因瘦素基因突變而明顯減弱。Seemann等[40]也發現在骨折合并TBI后，瘦素缺乏消除了TBI對骨愈合的積極作用。Garbe等[41]研究發現，在瘦素缺乏情況下，無法檢測到骨折創傷后特異性骨鈣素升高變化，再次證明了瘦素在創傷后骨骼和大腦特異性信號傳導中具有重要作用。
1.2.2 IGF-1
IGF-1產生于肝臟中，是一種類似于胰島素原的蛋白多肽，生長激素可以促進IGF-1的產生，進而誘導有絲分裂，與成骨細胞膜上的高親和力受體相結合，可促進有絲分裂，影響成骨細胞分化，并促進骨的生長與重建[42]。孫良智等[43]研究發現單純TBI組和骨折合并TBI組大鼠血清IGF-1濃度均高于正常對照組和單純骨折組，而且骨折合并TBI組大鼠骨折愈合明顯快于單純骨折組，因此推測IGF-1可能是TBI促進骨折愈合的原因之一。
1.2.3 褪黑素
褪黑素主要由松果體中的松果細胞在黑暗環境中合成和分泌，除了能調控睡眠和晝夜節律外，還對骨質疏松癥、骨折愈合、骨關節炎和類風濕性關節炎等骨和軟骨相關疾病具有有益作用[44-45]。褪黑素可以同步外周組織中的生物鐘，維持骨代謝與光暗周期同步。Shino等[46]發現褪黑素通過增加新生血管形成和成骨細胞增殖促進大鼠顱骨骨缺損處的骨再生。Sethi等[47]發現長期使用褪黑素處理人MSCs后，褪黑素1b受體（melatonin 1b receptor，MT2R）誘導成骨基因 Runx-2、骨鈣素和 BMP-2 表達。褪黑素處理21 d后，人MSCs內形成MT2R/G蛋白偶聯受體/β-抑制蛋白/分裂原活化抑制劑/ERK1/2復合物來誘導細胞成骨分化。同時，Dong等[48]也發現褪黑素可上調BMSCs中神經肽Y（neuropeptide Y，NPY）和NPY1受體（NPY1 receptor，NPY1R）的表達，并通過NPY/NPY1R信號通路促進BMSCs增殖、遷移和向成骨細胞分化，促進大鼠骨折愈合。當TBI導致創傷性蛛網膜下腔出血時，腦脊液中褪黑素含量顯著增加[49]，結合褪黑素在骨骼調節中的重要作用，TBI引起的褪黑素含量增加可能是骨折合并TBI患者骨折快速愈合的誘因。
2 神經因素
越來越多證據表明，神經系統在調節骨骼穩態方面起著關鍵作用[50]。神經系統不僅通過合成、分泌信號素3A（semaphorin-3A，Sema3A）、NPY等直接作用于骨膜中成骨細胞、破骨細胞發揮作用，骨折周圍的神經末梢在骨折愈合過程中也起到重要作用。骨骼表面受到豐富的感覺神經末梢支配，周圍神經在骨折處直接作用于骨膜組織，促進了骨折周圍血管再生和BMSCs的成骨分化，進而促進骨折愈合[5]。同時，TBI伴隨著交感神經張力顯著升高，研究發現化學交感神經切除術可阻斷 TBI 誘導的骨折愈合[51]。因此，交感神經張力升高也是TBI促進骨折愈合的因素之一。
2.1 神經因子
2.1.1 Sema3A和神經纖維蛋白1（neuropilin 1，Nrp1）
Sema3A是一種分泌性蛋白，屬于3號信號素家族，作為神經軸突發育的關鍵信號蛋白之一參與多種生理過程。 Sema3A與Nrp1的結合通過抑制免疫受體酪氨酸激活基序（ITAM）和RhoA信號通路來抑制NF-κB受體激活劑（RANKL）誘導的破骨細胞分化[52]。此外，Sema3A和Nrp1結合后通過典型的Wnt/β-catenin信號通路刺激成骨細胞分化，并抑制脂肪細胞分化。李爭爭等[53]研究發現TBI后軟骨骨痂中的軟骨細胞高表達Nrp1和Sema3A，可能通過促進軟骨細胞分化和增殖、排斥神經纖維在軟骨骨化中心內長入以及降低成骨細胞分化等調節骨重建。因此，在骨折合并TBI的骨折愈合過程中，Sema3A通過對成骨細胞的促分化和破骨細胞的抑分化作用來調節骨重塑，通過抑制骨吸收和增加骨形成發揮骨保護作用。此外，重組人Sema3A抑制了培養的人細胞中破骨細胞生成，促進了成骨細胞生成[54]。
2.1.2 NPY
神經肽最早發現于神經組織中，是一種調節神經系統功能的特殊信息物質；后期研究發現神經肽在生物發育的各個階段對各種生理功能起重要調控作用[55]。神經肽包含降鈣素基因相關肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）、NPY等。胡朝暉等[56]發現在TBI合并骨折患者的血清中，NPY含量明顯高于單純骨折組，從而推測NPY在TBI促進骨折愈合中起重要作用。Gu等[57]發現在骨折合并TBI患者血清中NPY表達量明顯升高，體外實驗表明NPY促進MSCs表達NPY1R，并促進MSCs向成骨細胞分化，從而促進骨折愈合。Tang等[58]發現骨折愈合過程中，大鼠血清中NPY和CGRP水平顯著升高；NPY和CGRP水平在第8周達到峰值，此后顯著下降；NPY和CGRP抑制劑可以抑制骨折愈合并下調磷酸化ERK的表達。因此，可以推測NPY和CGRP通過激活ERK通路促進骨折愈合。
2.1.3 CGRP
CGRP廣泛分布于中樞、外周神經系統和骨組織中，骨組織中的CGRP主要由骨骼中密集分布的感覺神經元纖維產生。在機械和生化刺激下，CGRP釋放并發揮生理或病理生理作用[59]。研究發現CGRP通過Hippo 通路的關鍵下游效應物 Yes相關蛋白（YAP）促進BMSCs的募集[60]；CGRP還可以通過經典的Wnt/β-catenin信號通路和cAMP反應元件結合蛋白（CREB）信號通路促進成骨細胞成骨及誘導BMSCs向成骨細胞分化[61-62]。當大腦受傷時，中樞神經系統會反射性地分泌更多CGRP來保護大腦，然而CGRP會透過損傷的血腦屏障到達血液，血清中CGRP含量急劇升高促進了骨折愈合[63]。同時，感覺神經末梢也可以釋放CGRP，通過自分泌或旁分泌作用于靶細胞，TBI發生時感覺神經末梢釋放CGRP增加[58]。因此，骨折合并TBI患者除了腦神經釋放的CGRP透過血腦屏障入血，骨折周圍感覺神經末梢同樣釋放CGRP，導致骨折局部CGRP含量顯著增加，加速骨折愈合[64]。可見CGRP在TBI加速骨折愈合機制中發揮重要作用。
同時CGRP參與了免疫應答，小鼠體內CGRP的缺乏抑制了M2巨噬細胞極化[65]；CGRP升高可以通過蛋白激酶A（PKA）和蛋白激酶C（PKC）途徑促進M2巨噬細胞極化[66]，巨噬細胞向M2方向極化，會抑制炎癥發展。這兩項研究報道了CGRP對M1巨噬細胞數量的負面影響，CGRP誘導的M2巨噬細胞總體增加可能有助于促進骨再生[67]。
2.1.4 NGF
NGF是一種神經營養因子，調節神經元的生長、發育、分化、再生和功能蛋白表達。研究發現NGF受體存在于成骨細胞上，與NGF結合后被NGF受體磷酸化，促進骨細胞生長[15]。同時，已有研究表明，NGF可通過其他神經肽和激素等內分泌因子促進骨細胞增殖和分化，抑制破骨細胞形成，從而促進骨折愈合。Xu等[64]發現TBI合并骨折組血清NGF含量顯著高于單純骨折組和對照組，可能由于血清中NGF不止來源于骨折周圍神經纖維釋放，腦脊液中的NGF也透過損傷的血腦屏障大量進入外周血，導致血清NGF含量急劇升高。因此，NGF不僅可以通過神經末梢以旁分泌形式促進骨折愈合，中樞神經釋放NGF也介導了TBI促進骨折愈合的發生。
2.2 感覺神經/運動神經
發育成熟的骨組織受感覺神經末梢支配，感覺神經的重要作用是傳遞傷害性信號，這些信號在骨折后變得非常強烈，并且在骨折愈合過程中起到關鍵作用[68]。骨折后骨膜基質祖細胞和骨折相關巨噬細胞中NGF表達顯著上調，NGF通過直接激活表達原肌球蛋白受體激酶A（TrkA）的感覺神經元或通過間接機制傳遞傷害性信號，是骨折修復過程中再生組織內神經再支配、血管形成和隨后的成骨細胞合成活動所必需的[69]。同時，感覺神經末梢釋放大量Sema3A，作用于成骨細胞促進成骨細胞分化[68]。綜上，骨折的疼痛激活了感覺神經，活化的感覺神經通過釋放Sema3A促進了骨折愈合。
研究發現周圍神經促進骨折愈合的另一種機制可能是通過直接激活骨膜中的骨膜祖細胞發揮促成骨作用。Morioka等[50]發現TBI和骨折發生在肢體不同側時骨愈合加速更顯著，這可能是由于皮質脊髓束纖維從中樞神經系統的一側向另一側靠近延髓和脊髓交界處的解剖交叉（“金字塔對撞”）造成的，表明某種神經元機制可能導致對側骨折愈合激活。進一步研究發現，神經貫穿整個骨骼，骨膜正下方的神經直接作用于骨膜中的骨軟骨祖細胞，刺激其增殖或增加局部成骨因子濃度促進成骨[70]。
目前，通過干預周圍神經促進骨折愈合已經開展多項動物實驗，比如Mi等[71]發現電刺激通過激活鈣/鈣相關蛋白Ⅱ（CaMKⅡ）/CREB信號通路和動作電位，直接促進CGRP的合成和釋放。作者設計了軟電極裝置，并將其植入大鼠L3和L4背根神經節，促進以CGRP減少為主要表現的大鼠骨折愈合；骨折后前2周在背根神經節進行電刺激，可增加背根神經節和骨折骨痂中CGRP的表達。該研究還發現，CGRP是H型血管形成不可或缺的因子，最終可促進骨折愈合。未來這項技術可能應用于臨床，通過刺激骨折患者腰椎背根神經節促進骨折愈合。
2.3 交感神經
近年大量研究表明交感神經調節骨形成，如Chen等[72]發現成骨細胞分泌的前列腺素 E2可激活感覺神經 EP4 受體，通過抑制交感神經活動調節骨形成。TBI 患者處于應激狀態，表現出長期的交感神經系統過度活躍，以交感-腎上腺髓質興奮為主[73]。Liu等[51]研究發現TBI介導的交感神經激活加速了骨折愈合過程，TBI誘導的腎上腺素能信號超敏反應促進了骨髓造血干細胞增殖，并在14 d內迅速向抗炎髓系細胞傾斜，有利于骨折愈合。該過程是由腎上腺素能受體（adrenergic receptor，AR）介導的，敲除β3-AR或β2-AR可消除腦損傷介導的抗炎、巨噬細胞擴張和腦損傷加速骨折愈合。并且，β2-AR的缺失會抑制骨折小鼠體內巨噬細胞的M2極化；在β3-AR基因敲除小鼠中，腦損傷誘導的骨髓造血干細胞增殖受到損害；β2-AR和β3-AR的選擇性激動劑可協同促進骨愈合過程。因此，激活的交感神經可驅動骨髓生成以促進TBI小鼠骨折愈合。
3 免疫因素
組織和細胞損傷都會伴隨炎癥，炎癥主要分為變質、滲出和增生3個階段，骨折后同樣伴隨骨組織的變質、滲出和增生[74]。首先破骨細胞和巨噬細胞對破碎骨質、細胞進行吸收，炎癥細胞通過血管滲出到達骨質處，通過釋放各種炎癥因子誘導各類炎癥細胞趨化形成“炎癥瀑布”，后期各類炎癥因子誘導血管內皮細胞再生，以出芽的形式在骨折周圍形成豐富的毛細血管網[75]。通過對小鼠骨折的研究表明，損傷后3～5 d的血腫形成和強烈的促炎反應是啟動骨愈合所必需的，而損傷后10～14 d是愈傷組織從軟骨過渡到骨骼的階段，此時炎癥需要消退骨折才能正常愈合[50]。
骨折愈合初期，骨皮質內、髓腔內和骨膜周圍血管破裂形成富含纖維蛋白的血腫，血腫內活化血小板產生的趨化因子可加速中性粒細胞和巨噬細胞向骨折部位遷移[76]。這些炎癥細胞會清除骨折周圍壞死組織，釋放炎癥因子趨化炎癥細胞和來自骨髓、骨膜、軟組織及全身循環的祖細胞相繼加入骨折愈合[77]。比如，肥大細胞通過IL-1β、TNF、角質形成細胞趨化因子和CXC 趨化因子配體 2調節血管滲漏和吸引中性粒細胞，中性粒細胞進一步將巨噬細胞招募到骨折部位，這對于骨再生至關重要[78]。
研究發現IL-6在TBI早期（傷后1 h）由神經元和巨噬細胞產生，對炎癥反應具有雙向調控作用，IL-6可抑制TNF-α合成、促進NGF合成、促進神經元存活和分化以及拮抗N-甲基-D-天冬氨酸發揮抗炎作用[79]，其中NGF具有促進骨折愈合的作用[15]，而IL-6在骨折愈合后期通過發揮抗炎作用來促進骨折愈合。炎癥急性期參與骨折愈合的細胞因子包括TNF-α、IL-1β和IL-6等，急性期過后IL-1β由巨噬細胞產生，并能夠誘導成骨細胞產生IL-6以促進血管生成和軟骨骨痂生成。研究結果表明血清IL-1β水平升高可能是骨折合并TBI患者骨折愈合加速的原因之一[80]。
合并TBI的骨折小鼠存在全身炎癥反應失調，角質形成細胞趨化因子和單核細胞趨化蛋白1表達顯著增加，而趨化因子配體10在合并TBI小鼠的全身和局部血腫中含量顯著降低[75]。Haffner-Luntzer等[3]研究發現骨折合并TBI小鼠血腫內IL-6和CXCL10含量顯著低于單純骨折小鼠，并且血腫內中性粒細胞、肥大細胞明顯減少。CXCL10來源于肥大細胞，能促進破骨細胞生成。因此TBI小鼠骨折血腫內肥大細胞減少導致CXCL10合成減少，從而破骨細胞減少，骨痂重塑減少，這可能是骨折合并TBI小鼠骨折骨痂中骨含量增加的原因之一。
4 總結與展望
骨折修復是一個復雜而有序的病理過程，當機體內環境穩態被破壞，神經、體液及免疫會共同調節修復機體創傷。目前關于TBI促進骨折愈合有幾種比較主流的學說，如干細胞學說、細胞因子學說、激素學說或機械學說等，但TBI促進骨折愈合機制不僅僅是某個或某幾種因子的作用，而是眾多因素在空間和時間上形成的復雜相互作用及交織的調節網絡共同影響骨再生。因此，今后研究需要整體觀察TBI后骨再生過程中相關因素在不同時間和空間的表達情況，并進一步探究其相互影響及作用機制。隨著科學技術進步，TBI后骨折愈合加速的病理生理機制將逐步被明確，從而為臨床上骨折不愈合、骨折延遲愈合、異位骨化的治療提供充分依據。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；課題經費支持沒有影響文章觀點及其報道
作者貢獻聲明 李懷任：內容構思、文獻查找、文章撰寫；韓鳳平：輔助文獻收集；孟靜：文章審閱和修改；常文利：對文章結構進行指導；馮立：文章設計、統籌、基金支持、對學術內容進行指導修改
骨折不愈合或延遲愈合發生率達5%～10%，其治療對于創傷外科醫生是一重大挑戰[1]，如何降低骨折不愈合發生率是亟待解決的問題。創傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）與骨折愈合關系密切，20世紀60年代Calandriello[2]發現重型顱腦損傷合并骨折患者與單純骨折患者相比會形成更多骨痂組織；此后關于TBI與骨折愈合關系的研究越來越多，TBI促進骨折愈合的觀點逐漸被學界認同。研究者們設想通過探索TBI促進骨折愈合機制，找到治療骨折不愈合新靶點。研究發現TBI常伴隨補體、趨化因子和炎癥遞質的釋放，從而促進炎癥反應發生[3]，同時血腦屏障完整性被破壞，導致腦脊液中小分子物質入血，通過蛋白組學檢測發現TBI合并骨折患者血清中多種物質含量與單純骨折患者存在明顯差異[4]，這些因素對骨折愈合有密切影響。然而，TBI促進骨折愈合的病理生理過程仍未完全闡明。本文擬從體液、神經及免疫3個方面對TBI加速骨折愈合的作用機制研究進展進行綜述，為骨折不愈合的臨床治療提供依據。
1 體液因素
大量臨床前和臨床試驗證明TBI后的血腦屏障通透性增加，中樞神經系統合成，釋放的小分子物質通過血腦屏障滲漏到外周循環中，導致體液中各種成骨因子濃度增加[5]。其中包括神經系統為修復自身損傷而分泌的促血管再生因子（如VEGF、BMP-2等），促進組織修復的FGF-2、TGF-β1等；以及神經系統在TBI后，一部分維持正常生理功能的激素表達增強，如瘦素、褪黑素等。另外，有研究表明使用TBI患者的血清培養MSCs，可以加速MSCs成骨分化，進一步提示TBI加速骨愈合可能涉及全身體液因素[3]。
1.1 細胞因子
1.1.1 VEGF
VEGF是血管內皮細胞的特異性有絲分裂原，不僅參與血管生成，在軟骨內骨化和膜內骨化過程中均起一定作用，還參與骨骼發育的各個方面，包括軟骨細胞分化、成骨細胞分化和破骨細胞募集[6]。VEGF是血管生成過程中不可或缺的因素，VEGF依賴性血管侵犯是軟骨吸收與骨形成相結合的必要條件[7]。另外，VEGF參與調節成骨細胞和脂肪細胞分化之間的平衡，通過調節轉錄因子Runt相關轉錄因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）和過氧化物酶體增殖物激活受體γ2（PPARγ2），以及通過與核包膜蛋白層粘連蛋白A/C的相互作用來控制MSCs的分化[8-9]。
TBI通常繼發病理性損傷引起腦缺血、缺氧，從而上調缺氧誘導因子的表達，最終腦組織VEGF表達升高[10-11]。VEGF通過受損的血腦屏障進入體液循環，誘導血管生成和成骨細胞增殖分化，從而促進骨折愈合和新骨形成[12]。李繼慶等[13]發現骨折合并TBI患者血清中的VEGF濃度明顯高于單純骨折組，且骨折愈合更快。既往研究表明，VEGF對于成骨細胞具有趨化作用，對骨的形成與重建有重要作用[14]。Zhang 等[15]發現鎖骨骨折合并TBI患者血清中VEGF濃度較單純鎖骨骨折患者更高，鎖骨愈合更快。因此，TBI可能通過上調VEGF的表達來加速骨折愈合。
1.1.2 TGF-β1
TGF-β1 是一種主要存在于骨基質中的多肽分子，可調節骨細胞增殖與分化，促進新骨形成，并在一定條件下抑制骨吸收，是骨組織修復和再生中的重要調節因子[16]。Xia等[17]發現在小鼠骨折愈合過程中，骨膜細胞TGF-β1/Smad2信號持續被激活，并且TGF-β1可誘導骨膜細胞早期分化為軟骨細胞，軟骨細胞進一步分化為成骨細胞，從而促進小鼠骨折愈合。使用TGF-β1抑制劑可導致骨折小鼠軟骨內骨形成延遲和受損[17]。因此，TGF-β1信號通過調節骨膜細胞的軟骨形成過程，在骨折愈合修復中起著至關重要的作用。馬維等[18]研究發現當TBI和骨折同時發生時，骨折合并TBI大鼠血清中 TGF-β1 的表達強于單純骨折大鼠，因為TGF-β1通過受損的血腦屏障進入全身循環，進一步促進骨生長和修復，表明TBI導致血清中TGF-β1增加對骨愈合和生長具有重要作用。
1.1.3 BMP-2
作為TGF-β超家族的重要成員，BMP是一種非常強大的細胞因子，控制著大量生物過程，包括腎臟發育、手指和肢體形成、血管生成、組織纖維化和腫瘤發育等[19]。BMP可以誘導骨骼和軟骨形成，刺激成骨細胞和軟骨細胞分化。在骨骼和軟骨發育過程中，BMP通過激活Smad信號來調節幾種轉錄因子的表達和功能[20-21]。遺傳研究表明，Runx2、成骨細胞特異性轉錄因子（Osterix）和Y染色體性別決定區盒轉錄因子9（Sox9）均在BMP下游發揮作用，在骨骼及軟骨發育中起著至關重要的作用[22-24]。另外，BMP還可以上調PDGF、VEGF和IGF-1等生長因子的表達，參與MSCs的早期募集，在整個成骨和成軟骨分化過程中持續存在，直到形成編織骨[25-26]。郭啟等[27]研究發現，骨折合并TBI組比單純骨折組表達更多BMP-2。BMP-2作為成骨細胞和軟骨細胞表型的主要分化觸發因素，通過激活Smad1/5/8 信號通路驅動骨形成導致骨和軟骨形成，在TBI促進骨折愈合機制中扮演重要角色。
1.1.4 FGF-2
FGF-2屬于FGF家族，在人體內發揮組織穩態、修復、再生、血管生成和骨代謝的重要作用[28-29]。FGF-2可以激活多種絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路，誘導細胞有絲分裂、炎癥反應和應激反應，參與細胞周期、細胞骨架形成和細胞遷移[30]。FGF-2通過磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）-蛋白激酶B （AKT）通路調節MSCs遷移[31]，通過激活細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）1/2途徑促進BMSCs增殖、成骨細胞增殖和分化，在成骨細胞和軟骨細胞分化過程中起著非常重要的作用[32-33]。FGF-2除了參與骨骼發育、骨形成和骨折修復，還在血管生成中具有關鍵作用。其可刺激血管生長，與VEGF、PDGF具有協同作用[28]。Mollahosseini等[34]研究表明股骨骨折合并TBI組患者血清中FGF-2和 PDGF 水平明顯高于其他組，并且與單純股骨骨折患者相比，骨折合并TBI組的股骨骨折愈合時間更短。
1.2 激素
1.2.1 瘦素
早期研究發現，瘦素是一種由脂肪組織分泌的激素，通過負反饋機制調控生物體的能量平衡以及體質量。目前研究發現，瘦素是一種多效性激素，參與調節多個器官系統的功能穩態，如胰島素穩態、生殖、免疫功能和大腦發育[35]。瘦素也被證明是調節骨代謝的重要因素，并提出了一種雙重機制（中樞和外周），其中瘦素通過中樞神經系統減少骨骼生長，同時在外周作為骨生長的促進劑，通過中樞神經系統調節生長激素分泌的代謝信號[36-37]。Yan等[38]探討了瘦素與TBI之間的關系，發現TBI后血清和腦脊液中的瘦素水平顯著升高；Graef等[39]發現瘦素缺乏小鼠骨折愈合較野生型小鼠減慢，而且TBI加速骨折愈合的機制因瘦素基因突變而明顯減弱。Seemann等[40]也發現在骨折合并TBI后，瘦素缺乏消除了TBI對骨愈合的積極作用。Garbe等[41]研究發現，在瘦素缺乏情況下，無法檢測到骨折創傷后特異性骨鈣素升高變化，再次證明了瘦素在創傷后骨骼和大腦特異性信號傳導中具有重要作用。
1.2.2 IGF-1
IGF-1產生于肝臟中，是一種類似于胰島素原的蛋白多肽，生長激素可以促進IGF-1的產生，進而誘導有絲分裂，與成骨細胞膜上的高親和力受體相結合，可促進有絲分裂，影響成骨細胞分化，并促進骨的生長與重建[42]。孫良智等[43]研究發現單純TBI組和骨折合并TBI組大鼠血清IGF-1濃度均高于正常對照組和單純骨折組，而且骨折合并TBI組大鼠骨折愈合明顯快于單純骨折組，因此推測IGF-1可能是TBI促進骨折愈合的原因之一。
1.2.3 褪黑素
褪黑素主要由松果體中的松果細胞在黑暗環境中合成和分泌，除了能調控睡眠和晝夜節律外，還對骨質疏松癥、骨折愈合、骨關節炎和類風濕性關節炎等骨和軟骨相關疾病具有有益作用[44-45]。褪黑素可以同步外周組織中的生物鐘，維持骨代謝與光暗周期同步。Shino等[46]發現褪黑素通過增加新生血管形成和成骨細胞增殖促進大鼠顱骨骨缺損處的骨再生。Sethi等[47]發現長期使用褪黑素處理人MSCs后，褪黑素1b受體（melatonin 1b receptor，MT2R）誘導成骨基因 Runx-2、骨鈣素和 BMP-2 表達。褪黑素處理21 d后，人MSCs內形成MT2R/G蛋白偶聯受體/β-抑制蛋白/分裂原活化抑制劑/ERK1/2復合物來誘導細胞成骨分化。同時，Dong等[48]也發現褪黑素可上調BMSCs中神經肽Y（neuropeptide Y，NPY）和NPY1受體（NPY1 receptor，NPY1R）的表達，并通過NPY/NPY1R信號通路促進BMSCs增殖、遷移和向成骨細胞分化，促進大鼠骨折愈合。當TBI導致創傷性蛛網膜下腔出血時，腦脊液中褪黑素含量顯著增加[49]，結合褪黑素在骨骼調節中的重要作用，TBI引起的褪黑素含量增加可能是骨折合并TBI患者骨折快速愈合的誘因。
2 神經因素
越來越多證據表明，神經系統在調節骨骼穩態方面起著關鍵作用[50]。神經系統不僅通過合成、分泌信號素3A（semaphorin-3A，Sema3A）、NPY等直接作用于骨膜中成骨細胞、破骨細胞發揮作用，骨折周圍的神經末梢在骨折愈合過程中也起到重要作用。骨骼表面受到豐富的感覺神經末梢支配，周圍神經在骨折處直接作用于骨膜組織，促進了骨折周圍血管再生和BMSCs的成骨分化，進而促進骨折愈合[5]。同時，TBI伴隨著交感神經張力顯著升高，研究發現化學交感神經切除術可阻斷 TBI 誘導的骨折愈合[51]。因此，交感神經張力升高也是TBI促進骨折愈合的因素之一。
2.1 神經因子
2.1.1 Sema3A和神經纖維蛋白1（neuropilin 1，Nrp1）
Sema3A是一種分泌性蛋白，屬于3號信號素家族，作為神經軸突發育的關鍵信號蛋白之一參與多種生理過程。 Sema3A與Nrp1的結合通過抑制免疫受體酪氨酸激活基序（ITAM）和RhoA信號通路來抑制NF-κB受體激活劑（RANKL）誘導的破骨細胞分化[52]。此外，Sema3A和Nrp1結合后通過典型的Wnt/β-catenin信號通路刺激成骨細胞分化，并抑制脂肪細胞分化。李爭爭等[53]研究發現TBI后軟骨骨痂中的軟骨細胞高表達Nrp1和Sema3A，可能通過促進軟骨細胞分化和增殖、排斥神經纖維在軟骨骨化中心內長入以及降低成骨細胞分化等調節骨重建。因此，在骨折合并TBI的骨折愈合過程中，Sema3A通過對成骨細胞的促分化和破骨細胞的抑分化作用來調節骨重塑，通過抑制骨吸收和增加骨形成發揮骨保護作用。此外，重組人Sema3A抑制了培養的人細胞中破骨細胞生成，促進了成骨細胞生成[54]。
2.1.2 NPY
神經肽最早發現于神經組織中，是一種調節神經系統功能的特殊信息物質；后期研究發現神經肽在生物發育的各個階段對各種生理功能起重要調控作用[55]。神經肽包含降鈣素基因相關肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）、NPY等。胡朝暉等[56]發現在TBI合并骨折患者的血清中，NPY含量明顯高于單純骨折組，從而推測NPY在TBI促進骨折愈合中起重要作用。Gu等[57]發現在骨折合并TBI患者血清中NPY表達量明顯升高，體外實驗表明NPY促進MSCs表達NPY1R，并促進MSCs向成骨細胞分化，從而促進骨折愈合。Tang等[58]發現骨折愈合過程中，大鼠血清中NPY和CGRP水平顯著升高；NPY和CGRP水平在第8周達到峰值，此后顯著下降；NPY和CGRP抑制劑可以抑制骨折愈合并下調磷酸化ERK的表達。因此，可以推測NPY和CGRP通過激活ERK通路促進骨折愈合。
2.1.3 CGRP
CGRP廣泛分布于中樞、外周神經系統和骨組織中，骨組織中的CGRP主要由骨骼中密集分布的感覺神經元纖維產生。在機械和生化刺激下，CGRP釋放并發揮生理或病理生理作用[59]。研究發現CGRP通過Hippo 通路的關鍵下游效應物 Yes相關蛋白（YAP）促進BMSCs的募集[60]；CGRP還可以通過經典的Wnt/β-catenin信號通路和cAMP反應元件結合蛋白（CREB）信號通路促進成骨細胞成骨及誘導BMSCs向成骨細胞分化[61-62]。當大腦受傷時，中樞神經系統會反射性地分泌更多CGRP來保護大腦，然而CGRP會透過損傷的血腦屏障到達血液，血清中CGRP含量急劇升高促進了骨折愈合[63]。同時，感覺神經末梢也可以釋放CGRP，通過自分泌或旁分泌作用于靶細胞，TBI發生時感覺神經末梢釋放CGRP增加[58]。因此，骨折合并TBI患者除了腦神經釋放的CGRP透過血腦屏障入血，骨折周圍感覺神經末梢同樣釋放CGRP，導致骨折局部CGRP含量顯著增加，加速骨折愈合[64]。可見CGRP在TBI加速骨折愈合機制中發揮重要作用。
同時CGRP參與了免疫應答，小鼠體內CGRP的缺乏抑制了M2巨噬細胞極化[65]；CGRP升高可以通過蛋白激酶A（PKA）和蛋白激酶C（PKC）途徑促進M2巨噬細胞極化[66]，巨噬細胞向M2方向極化，會抑制炎癥發展。這兩項研究報道了CGRP對M1巨噬細胞數量的負面影響，CGRP誘導的M2巨噬細胞總體增加可能有助于促進骨再生[67]。
2.1.4 NGF
NGF是一種神經營養因子，調節神經元的生長、發育、分化、再生和功能蛋白表達。研究發現NGF受體存在于成骨細胞上，與NGF結合后被NGF受體磷酸化，促進骨細胞生長[15]。同時，已有研究表明，NGF可通過其他神經肽和激素等內分泌因子促進骨細胞增殖和分化，抑制破骨細胞形成，從而促進骨折愈合。Xu等[64]發現TBI合并骨折組血清NGF含量顯著高于單純骨折組和對照組，可能由于血清中NGF不止來源于骨折周圍神經纖維釋放，腦脊液中的NGF也透過損傷的血腦屏障大量進入外周血，導致血清NGF含量急劇升高。因此，NGF不僅可以通過神經末梢以旁分泌形式促進骨折愈合，中樞神經釋放NGF也介導了TBI促進骨折愈合的發生。
2.2 感覺神經/運動神經
發育成熟的骨組織受感覺神經末梢支配，感覺神經的重要作用是傳遞傷害性信號，這些信號在骨折后變得非常強烈，并且在骨折愈合過程中起到關鍵作用[68]。骨折后骨膜基質祖細胞和骨折相關巨噬細胞中NGF表達顯著上調，NGF通過直接激活表達原肌球蛋白受體激酶A（TrkA）的感覺神經元或通過間接機制傳遞傷害性信號，是骨折修復過程中再生組織內神經再支配、血管形成和隨后的成骨細胞合成活動所必需的[69]。同時，感覺神經末梢釋放大量Sema3A，作用于成骨細胞促進成骨細胞分化[68]。綜上，骨折的疼痛激活了感覺神經，活化的感覺神經通過釋放Sema3A促進了骨折愈合。
研究發現周圍神經促進骨折愈合的另一種機制可能是通過直接激活骨膜中的骨膜祖細胞發揮促成骨作用。Morioka等[50]發現TBI和骨折發生在肢體不同側時骨愈合加速更顯著，這可能是由于皮質脊髓束纖維從中樞神經系統的一側向另一側靠近延髓和脊髓交界處的解剖交叉（“金字塔對撞”）造成的，表明某種神經元機制可能導致對側骨折愈合激活。進一步研究發現，神經貫穿整個骨骼，骨膜正下方的神經直接作用于骨膜中的骨軟骨祖細胞，刺激其增殖或增加局部成骨因子濃度促進成骨[70]。
目前，通過干預周圍神經促進骨折愈合已經開展多項動物實驗，比如Mi等[71]發現電刺激通過激活鈣/鈣相關蛋白Ⅱ（CaMKⅡ）/CREB信號通路和動作電位，直接促進CGRP的合成和釋放。作者設計了軟電極裝置，并將其植入大鼠L3和L4背根神經節，促進以CGRP減少為主要表現的大鼠骨折愈合；骨折后前2周在背根神經節進行電刺激，可增加背根神經節和骨折骨痂中CGRP的表達。該研究還發現，CGRP是H型血管形成不可或缺的因子，最終可促進骨折愈合。未來這項技術可能應用于臨床，通過刺激骨折患者腰椎背根神經節促進骨折愈合。
2.3 交感神經
近年大量研究表明交感神經調節骨形成，如Chen等[72]發現成骨細胞分泌的前列腺素 E2可激活感覺神經 EP4 受體，通過抑制交感神經活動調節骨形成。TBI 患者處于應激狀態，表現出長期的交感神經系統過度活躍，以交感-腎上腺髓質興奮為主[73]。Liu等[51]研究發現TBI介導的交感神經激活加速了骨折愈合過程，TBI誘導的腎上腺素能信號超敏反應促進了骨髓造血干細胞增殖，并在14 d內迅速向抗炎髓系細胞傾斜，有利于骨折愈合。該過程是由腎上腺素能受體（adrenergic receptor，AR）介導的，敲除β3-AR或β2-AR可消除腦損傷介導的抗炎、巨噬細胞擴張和腦損傷加速骨折愈合。并且，β2-AR的缺失會抑制骨折小鼠體內巨噬細胞的M2極化；在β3-AR基因敲除小鼠中，腦損傷誘導的骨髓造血干細胞增殖受到損害；β2-AR和β3-AR的選擇性激動劑可協同促進骨愈合過程。因此，激活的交感神經可驅動骨髓生成以促進TBI小鼠骨折愈合。
3 免疫因素
組織和細胞損傷都會伴隨炎癥，炎癥主要分為變質、滲出和增生3個階段，骨折后同樣伴隨骨組織的變質、滲出和增生[74]。首先破骨細胞和巨噬細胞對破碎骨質、細胞進行吸收，炎癥細胞通過血管滲出到達骨質處，通過釋放各種炎癥因子誘導各類炎癥細胞趨化形成“炎癥瀑布”，后期各類炎癥因子誘導血管內皮細胞再生，以出芽的形式在骨折周圍形成豐富的毛細血管網[75]。通過對小鼠骨折的研究表明，損傷后3～5 d的血腫形成和強烈的促炎反應是啟動骨愈合所必需的，而損傷后10～14 d是愈傷組織從軟骨過渡到骨骼的階段，此時炎癥需要消退骨折才能正常愈合[50]。
骨折愈合初期，骨皮質內、髓腔內和骨膜周圍血管破裂形成富含纖維蛋白的血腫，血腫內活化血小板產生的趨化因子可加速中性粒細胞和巨噬細胞向骨折部位遷移[76]。這些炎癥細胞會清除骨折周圍壞死組織，釋放炎癥因子趨化炎癥細胞和來自骨髓、骨膜、軟組織及全身循環的祖細胞相繼加入骨折愈合[77]。比如，肥大細胞通過IL-1β、TNF、角質形成細胞趨化因子和CXC 趨化因子配體 2調節血管滲漏和吸引中性粒細胞，中性粒細胞進一步將巨噬細胞招募到骨折部位，這對于骨再生至關重要[78]。
研究發現IL-6在TBI早期（傷后1 h）由神經元和巨噬細胞產生，對炎癥反應具有雙向調控作用，IL-6可抑制TNF-α合成、促進NGF合成、促進神經元存活和分化以及拮抗N-甲基-D-天冬氨酸發揮抗炎作用[79]，其中NGF具有促進骨折愈合的作用[15]，而IL-6在骨折愈合后期通過發揮抗炎作用來促進骨折愈合。炎癥急性期參與骨折愈合的細胞因子包括TNF-α、IL-1β和IL-6等，急性期過后IL-1β由巨噬細胞產生，并能夠誘導成骨細胞產生IL-6以促進血管生成和軟骨骨痂生成。研究結果表明血清IL-1β水平升高可能是骨折合并TBI患者骨折愈合加速的原因之一[80]。
合并TBI的骨折小鼠存在全身炎癥反應失調，角質形成細胞趨化因子和單核細胞趨化蛋白1表達顯著增加，而趨化因子配體10在合并TBI小鼠的全身和局部血腫中含量顯著降低[75]。Haffner-Luntzer等[3]研究發現骨折合并TBI小鼠血腫內IL-6和CXCL10含量顯著低于單純骨折小鼠，并且血腫內中性粒細胞、肥大細胞明顯減少。CXCL10來源于肥大細胞，能促進破骨細胞生成。因此TBI小鼠骨折血腫內肥大細胞減少導致CXCL10合成減少，從而破骨細胞減少，骨痂重塑減少，這可能是骨折合并TBI小鼠骨折骨痂中骨含量增加的原因之一。
4 總結與展望
骨折修復是一個復雜而有序的病理過程，當機體內環境穩態被破壞，神經、體液及免疫會共同調節修復機體創傷。目前關于TBI促進骨折愈合有幾種比較主流的學說，如干細胞學說、細胞因子學說、激素學說或機械學說等，但TBI促進骨折愈合機制不僅僅是某個或某幾種因子的作用，而是眾多因素在空間和時間上形成的復雜相互作用及交織的調節網絡共同影響骨再生。因此，今后研究需要整體觀察TBI后骨再生過程中相關因素在不同時間和空間的表達情況，并進一步探究其相互影響及作用機制。隨著科學技術進步，TBI后骨折愈合加速的病理生理機制將逐步被明確，從而為臨床上骨折不愈合、骨折延遲愈合、異位骨化的治療提供充分依據。
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