引用本文： 張宇坤, 胡漢卿, 盛祥宗, 吳宏宇, 張騫, 王貴玉. 結直腸腫瘤基礎研究中小鼠模型總結與對比. 中國普外基礎與臨床雜志, 2021, 28(6): 816-820. doi: 10.7507/1007-9424.202009011 復制
在結直腸癌基礎研究中，腫瘤細胞系實驗占據著主要陣地，但由于細胞處于體外，與體內環境相差較大，而且有研究[1-2]表明腫瘤細胞系因為傳代次數過多或支原體等病原微生物的污染，可能導致品系不純或突變產生，影響實驗結果的真實性。因此，研究人員為了增加研究結果的說服力和可信度，會在細胞實驗基礎上進行動物模型實驗，動物模型實驗不僅可以模擬體內環境，減少結果的不確定性，同時還避免了因腫瘤細胞系污染可能造成的實驗結果的偏差。目前，結直腸癌小鼠造模方法眾多，大致可以分為以下幾類：① 將腫瘤細胞系或者患者腫瘤組織接種到免疫缺陷小鼠體內，分別稱為細胞系來源的腫瘤移植模型（cell-derived xenograft，CDX）和患者腫瘤組織來源的腫瘤移植模型（patient-derived xenograft，PDX）；② 化學試劑誘導原位結直腸腫瘤；③ 基因工程小鼠，ApcMin/+小鼠誘導的結直腸腺瘤樣息肉目前應用最廣泛；④ 將來源于小鼠自身的腫瘤細胞接種至具有免疫能力正常的小鼠；⑤ 結直腸轉移瘤模型，包括肝臟轉移、肺轉移、骨轉移、腹膜轉移等。多種多樣的造模方法極大地促進了基礎研究的進展，但在實際研究過程中，正確地根據研究目的去選擇合適的結直腸腫瘤小鼠模型，對研究腫瘤的發生發展及藥物研發十分重要。所以，筆者在閱讀大量文獻和方法后，通過對上述幾種結直腸腫瘤動物模型的造模步驟、方法和優缺點進行了簡要歸納總結，以幫助科研人員選擇適合自己課題研究的造模方法，從而保證準確地證實自己的假設和猜想。
1 異體移植瘤模型
CDX 模型和 PDX 模型都屬于異體移植瘤模型，因此需要使用免疫缺陷小鼠來作為受體。既往結直腸腫瘤研究中廣泛使用了 CDX 模型，PDX 雖然出現時間較短，但因其更加符合真實的腫瘤生長環境而在臨床中占有一席之地。
1.1 CDX 模型
腫瘤細胞具有不死性、遷移性和喪失接觸抑制性[3]，因此，從結直腸癌患者組織中提取的經典結直腸腫瘤細胞系，在培養基和適宜培養條件下可無限增殖傳代，很容易獲得，將其注射在裸鼠皮下成瘤成為結直腸癌 CDX 小鼠模型，一般需要計數約 2×106 個細胞/只，之后將腫瘤細胞懸浮在磷酸鹽緩沖溶液中，使用 1 mL 注射器接種到裸鼠皮下，位置多數為腋下或腹股溝兩側脂肪墊較厚處。約 1 周后，肉眼即可在裸鼠皮下看到腫瘤結節。在藥物研發時，研究者通常先用人源腫瘤細胞系進行細胞增殖實驗檢測藥物抑制效果，之后再使用相同細胞系建立小鼠 CDX 模型進行體內初步驗證[4]。如Kang 等[5]為了證明其設計的雙氫青蒿素和阿霉素共給藥脂質體對耐藥結腸癌的作用就運用了此模型；同時，在研究腫瘤發生發展機制中也經常使用該模型。也有團隊將穩定表達 LncRNA-FEZF1-AS1 的細胞系接種至裸鼠皮下和靜脈，證實了 LncRNA-FEZF1-AS1 可以通過 PKM2 途徑促進結直腸腫瘤增殖和轉移[6]。CDX 小鼠模型建立方法簡單，成瘤耗時短，一般 1～2 周即可肉眼觀察到皮下結節狀突起，成瘤率高（基本為 100%）。而且在 CDX 模型中，腫瘤皮下移植瘤形態較為規則，成瘤后可以通過游標卡尺測量腫瘤長徑、短徑，計算腫瘤的質量體積，便于進行基因及藥物對瘤體增殖作用的相關研究。CDX 模型是結直腸腫瘤基礎研究中應用最為廣泛的動物模型。有相關研究[7]發現，人源腫瘤細胞系經長期體外培養后，其腫瘤細胞生物學行為及基因譜表達水平，以及腫瘤異質性都與原始腫瘤組織存在較大差異，在預測臨床藥效方面不甚理想。因此，為了避免發生上述情況發生，在模型建立之前，需要確保細胞系的來源及可靠性。
1.2 PDX 模型
近年來，在腫瘤研究中使用病例來源的移植瘤模型在學術界和工業界都備受關注，從包括結直腸癌在內的不同腫瘤類型中開發出 PDX 模型，以改進藥物開發過程。這些模型用于臨床前藥物評估，并可用于臨床結果的預測，因它們保留了腫瘤原有的異質性、微環境、分子多樣性等特征[8]，為分析腫瘤標志物、治療靶點和新型抗癌藥的發現提供了轉化機會[9]。結直腸癌 PDX 模型構造流程為：將手術獲得結直腸腫瘤組織切塊后，3 h 內將 1～2 塊組織移植至重癥聯合免疫缺陷（severe combined immune deficiency，SCID）小鼠皮下，待 SCID 小鼠成瘤后，將其安樂死獲得腫瘤，將腫瘤置于無菌磷酸鹽緩沖溶液中分為大小均一的組織塊，一般為 1～2 mm3（1 mm×1 mm×1 mm 或 1 mm×1 mm×2 mm），并立即接種至裸鼠皮下脂肪墊較厚處，待腫瘤長徑達 10 mm 后即用于后續實驗研究[10]。PDX 模型因其供體來源為臨床患者，為個體化精準醫學提供了切實可靠的模型，常用來為臨床晚期患者篩選合適的治療方案。相較于 CDX 模型，PDX 造模時動物需接受麻醉和切開皮膚處理，對實驗人員手術技能具有較高要求；患者腫瘤組織獲取較困難，經濟成本較高[11]。這些導致 PDX 模型應用受到限制。理想的替代模型應該是在保有 PDX 模型預測反應能力的同時，還能夠像細胞系一樣低成本短周期的應用。這需要科技工作者的進一步探索。
2 化學試劑誘導成瘤
長時間的化學試劑作用可以使小鼠結直腸原位成瘤，常見的方法主要有二甲肼腹腔注射法[12]、N-甲基-N-硝基-亞硝胍灌腸法和氧化偶氮甲烷-葡聚糖硫酸鈉（azoxymethane-dextran sulfate sodium，AOM-DSS）誘導法[13]。多數研究按照“四步法”來誘導結直腸癌小鼠模型，即在實驗初給予小鼠腹腔注射 AOM（10 mg/kg），間隔 1 周后給予 2.5% DSS 飲用 7 d，以后每間隔 2 周再給予 2.5% DSS 飲用 7 d，2 個循環；3 個 DSS 循環結束后即可將小鼠安樂死進行后續實驗[14]。在實驗過程中，記錄小鼠體質量、便血及糞便形狀，能夠在疾病嚴重程度方面對小鼠模型進行評價。雖然 AOM-DSS 模型誘導時間較長，使用到的化學試劑較為昂貴，但其在腸道原位模仿了炎癥誘導結直腸腫瘤的真實過程，對于研究炎癥性腸病相關結直腸腫瘤的發生進展機制及相關治療策略的研究具有重要價值[15-16]。此外，在研究結直腸腫瘤與腸道微生物、飲食、藥物間關系時，其能夠真實反映腫瘤和微生物變化，被廣泛應用于結直腸腫瘤與腸道菌群相關研究[17]；而且此模型中小鼠免疫系統健全，具有真實的腫瘤微環境，在篩選免疫治療藥物時也具有較好的說服力[18]。
3 基因工程小鼠
ApcMin/+結直腸腫瘤小鼠模型是使用載有 Cre 重組酶的腺病毒載體感染腸道組織，激活條件種系突變來實現腸道原位結直腸腺瘤形成[19]。在基礎研究中，通常研究者不具有構建此模型的基因工程技術，故此模型多購自動物模型公司，該操作方法不在此贅述。腺瘤性息肉病（adenomatous polyposis coli，APC）基因是結直腸癌抑癌基因，其主要通過編碼的 APC 蛋白作為 Wnt 信號通路的效應因子調節 β-catenin 表達從而調控細胞增殖，ApcMin 小鼠通過誘變使其 Apc 基因編碼亮氨酸的第 850 號密碼子轉變成終止密碼子，從而提前截斷蛋白，使 APC 蛋白失去抑癌作用而致結直腸腫瘤發生。故 Apc 基因突變是結直腸腫瘤的早期事件，多數 Apc 基因突變會導致結直腸腺瘤的發生，靶向 Apc 基因有助于對結直腸腫瘤癌前病變進行預防和治療干預[20-24]。同時，ApcMin/+小鼠與人類家族性多發息肉病（familial adenomatous polyposis，FAP）表現相似，是目前用于 FAP 藥物開發的理想模型[25]。ApcMin/+結直腸腫瘤小鼠模型也可見于結直腸腫瘤病因研究和治療藥物方面的相關研究[26-27]。ApcMin/+小鼠可模擬結直腸腫瘤發生的整個過程，包括腫瘤宿主的相互作用和轉移級聯，保留了小鼠真實的免疫力和腫瘤微環境。故該模型在研究腫瘤生物學和臨床前治療試驗方面具有重要應用價值。此外，科研工作者也可把臨床研究中發現的與結直腸腫瘤相關基因通過基因工程手段，如轉基因、基因編輯等方法復現在小鼠基因組上，驗證這種突變的致癌作用及機制。
4 小鼠自身腫瘤細胞移植
在腫瘤免疫學研究中，體內實驗是不可或缺的一部分，相比人體相關免疫實驗，小鼠實驗較易實施，符合倫理。常見的小鼠結直腸腫瘤細胞系有 CT-26 或者 MCA-38 細胞，將結直腸腫瘤細胞系接種至正常實驗用小鼠的皮下脂肪墊較厚處，接種的數量、方法和位置與人源結直腸腫瘤細胞系移植瘤大致相同。這種方法簡單易操作，且耗時短，約 4～5 周即可結束實驗。CT-26 腫瘤細胞具有最高的腫瘤突變荷載，Zhang 等[28]將 CT-26 細胞接種至 C57 小鼠，通過免疫檢查點抑制受體 T 細胞免疫球蛋白和免疫受體酪氨酸抑制基序結構域蛋白（TIGIT），發現可以增強自然殺傷細胞功能從而介導強大的抑癌作用。此外，此模型也可被應用于除免疫外的其他研究。Park 等[29]團隊使用此模型觀察到木瓜籽乙醇提取物對結直腸腫瘤的抑制作用。此模型將小鼠腫瘤細胞系移植到遺傳背景相同不會發生免疫排斥的其他小鼠體內，相當于自體移植，也可稱為同基因型腫瘤移植模型。移植瘤可以大量制備，荷瘤小鼠之間均一性好，故適用于研究腫瘤和免疫系統之間的相互作用及抗腫瘤免疫藥物的初步篩選。與前面所述的 CDX 模型相比，小鼠腫瘤細胞種植模型缺乏可信的免疫微環境，腫瘤細胞系也會因傳代次數過多或污染而喪失其特征，故確保腫瘤細胞的可靠性應引起研究者的重視。
5 結直腸腫瘤轉移瘤模型的建立
90% 以上結直腸癌患者死亡的原因系腫瘤轉移及其并發癥，而非原發腫瘤。結直腸腫瘤轉移無疑成為影響患者預后的主要因素，也成為結直腸腫瘤研究的主要攻克點。結直腸腫瘤轉移模型可模擬部分或全部的腫瘤轉移過程，有助于對結直腸腫瘤轉移過程的研究及抗腫瘤轉移藥效的評估[30]。結直腸腫瘤常見轉移部位有肝、肺、腹腔種植，終末期可發生腦和骨轉移[31]。現就此作一詳細介紹。
5.1 結直腸癌肝轉移模型
結直腸癌肝轉移模型分為自發性結直腸癌肝轉移小鼠模型和實驗性結直腸癌肝轉移小鼠模型。前者是將結直腸癌細胞系或組織種植在免疫缺陷小鼠結腸或直腸壁黏膜層，使其生成原位腫瘤，之后發生肝轉移，該過程還原了從結直腸癌發生直至肝轉移的整個過程，耗時較長[32]。而實驗性結直腸癌肝轉移小鼠模型是將結直腸腫瘤細胞系注射在免疫缺陷小鼠脾臟后，結直腸腫瘤細胞通過血液循環轉移到肝臟，該模型還原了臨床中腫瘤切除術后癌細胞回流入門靜脈至肝臟時的血道播散而發生肝轉移的過程，腫瘤轉移率較高，成為研究結直腸癌肝轉移機制和抗轉移治療的常用模型[33]。
5.2 結直腸癌肺轉移模型
臨床上，在轉移性結直腸腫瘤患者中，肝肺同時轉移的患者并不少見[34]。同樣，在實驗中，結直腸癌肝轉移動物模型可自行發生進展為肺轉移，還原了臨床上結直腸癌肝轉移后，腫瘤細胞經血行轉移發生遠處肺轉移的過程，然而，此過程發生較為緩慢。而尾靜脈注射法是將結直腸腫瘤細胞系經小鼠尾靜脈注射后，癌細胞通過肺部的毛細血管網進入動脈血液循環系統，可造成全身多發轉移灶，由于腫瘤細胞較為黏稠、易聚團，易于黏附在小鼠肺部微血管，主要形成肺轉移，是結直腸癌肺轉移模型中最常見的造模方法[35]。
5.3 結直腸癌腹腔種植模型的建立
結直腸癌腹腔種植轉移，是將結直腸癌細胞系（人源或鼠源）在裸鼠或正常小鼠上進行腹腔注射，使結直腸癌細胞系能夠在腹腔內擴散生長。約 10 d 后即可在腹腔觀察到腫瘤結節，模擬了外科術后結直腸癌腹腔種植擴散和終末期患者腹腔廣泛轉移的病理生理過程。對終末期轉移性結直腸癌的研究具有很大幫助[36]。
5.4 結直腸癌腦和骨轉移模型建立
將結直腸腫瘤細胞系經左心室注射，使其進入小鼠體循環，之后結直腸腫瘤細胞經過黏附、降解、遷移等過程，發生腦和骨骼轉移，可很好地模擬結直腸腫瘤細胞經過血道遠處轉移至骨和腦的過程[37]。
轉移瘤模型對手術操作要求較高，使用影像學技術判斷轉移瘤模型建立是否成功十分重要。因此有團隊采用裸鼠直腸黏膜下注射紅色熒光蛋白標記的人結直腸腺癌細胞系 HCT-116 建立原位移植瘤模型，并借助活體成像系統在不同時間點采集熒光信號圖像，實時觀察癌細胞在裸鼠直腸的生長和轉移情況[38]。以上轉移瘤模型，在保證細胞系來源可靠性的情況下，為針對結直腸癌遠處轉移機制及相關臨床藥物的研發做出了巨大貢獻。結直腸腫瘤常見小鼠模型優缺點見表 1。
表1
結直腸腫瘤常見小鼠模型優缺點匯總
6 展望
綜上所述，在需要體內造模時，研究者應根據其課題需要，在閱讀大量相關文獻實驗方法和材料的基礎上進行選擇，在這些結直腸腫瘤模型中，每個模型都有其優缺點。在使用小鼠種類方面，有正常小鼠及免疫缺陷小鼠（裸鼠）；從腫瘤來源方面，有人源、鼠源結直腸癌細胞系及結直腸腫瘤組織移植；從腫瘤位置來看，有結直腸原位、皮下種植及肝肺等器官的轉移。只有深入閱讀和思考這些模型的流程和特點，才能為科研人員后期的體內模型選擇提供正確的方向，從而讓實驗結果更具說服力。同時，既往可見將兩種模型同時應用于研究之中[39]，這極大地增加了研究的可信度。
結直腸癌的病因及發病機制十分復雜，目前廣泛使用的動物模型都有其優缺點及適用范圍，構造理想的動物模型是對結直腸癌深入研究的重要工具。因筆者閱讀文獻有限及研究技術的飛速發展，并未能將所有模型一一闡述。隨著結直腸腫瘤研究的不斷發展和深入，新的結直腸腫瘤相關模型層出不窮，如黃曉東團隊[40]利用基因工程技術，構建了 ApcloxP/loxP+KrasLSL- Gl2D/-雙轉基因的結直腸腫瘤模型小鼠，成瘤率達到 40%。可見時刻關注最新研究方法和進展對于科研工作者十分重要。筆者對動物模型的總結如下：時刻關注最新方法，選擇合適的模型類型，設置合理的預實驗，增強動手能力，形成團隊方法體系，一定能為研究結果增光添彩。
重要聲明
利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：張宇坤：醞釀和設計、起草文章；胡漢卿：批評性審閱；盛祥宗：批評性審閱；吳宏宇：批評性審閱；王貴玉，張騫：批評性審閱、指導、支持性貢獻。
在結直腸癌基礎研究中，腫瘤細胞系實驗占據著主要陣地，但由于細胞處于體外，與體內環境相差較大，而且有研究[1-2]表明腫瘤細胞系因為傳代次數過多或支原體等病原微生物的污染，可能導致品系不純或突變產生，影響實驗結果的真實性。因此，研究人員為了增加研究結果的說服力和可信度，會在細胞實驗基礎上進行動物模型實驗，動物模型實驗不僅可以模擬體內環境，減少結果的不確定性，同時還避免了因腫瘤細胞系污染可能造成的實驗結果的偏差。目前，結直腸癌小鼠造模方法眾多，大致可以分為以下幾類：① 將腫瘤細胞系或者患者腫瘤組織接種到免疫缺陷小鼠體內，分別稱為細胞系來源的腫瘤移植模型（cell-derived xenograft，CDX）和患者腫瘤組織來源的腫瘤移植模型（patient-derived xenograft，PDX）；② 化學試劑誘導原位結直腸腫瘤；③ 基因工程小鼠，ApcMin/+小鼠誘導的結直腸腺瘤樣息肉目前應用最廣泛；④ 將來源于小鼠自身的腫瘤細胞接種至具有免疫能力正常的小鼠；⑤ 結直腸轉移瘤模型，包括肝臟轉移、肺轉移、骨轉移、腹膜轉移等。多種多樣的造模方法極大地促進了基礎研究的進展，但在實際研究過程中，正確地根據研究目的去選擇合適的結直腸腫瘤小鼠模型，對研究腫瘤的發生發展及藥物研發十分重要。所以，筆者在閱讀大量文獻和方法后，通過對上述幾種結直腸腫瘤動物模型的造模步驟、方法和優缺點進行了簡要歸納總結，以幫助科研人員選擇適合自己課題研究的造模方法，從而保證準確地證實自己的假設和猜想。
1 異體移植瘤模型
CDX 模型和 PDX 模型都屬于異體移植瘤模型，因此需要使用免疫缺陷小鼠來作為受體。既往結直腸腫瘤研究中廣泛使用了 CDX 模型，PDX 雖然出現時間較短，但因其更加符合真實的腫瘤生長環境而在臨床中占有一席之地。
1.1 CDX 模型
腫瘤細胞具有不死性、遷移性和喪失接觸抑制性[3]，因此，從結直腸癌患者組織中提取的經典結直腸腫瘤細胞系，在培養基和適宜培養條件下可無限增殖傳代，很容易獲得，將其注射在裸鼠皮下成瘤成為結直腸癌 CDX 小鼠模型，一般需要計數約 2×106 個細胞/只，之后將腫瘤細胞懸浮在磷酸鹽緩沖溶液中，使用 1 mL 注射器接種到裸鼠皮下，位置多數為腋下或腹股溝兩側脂肪墊較厚處。約 1 周后，肉眼即可在裸鼠皮下看到腫瘤結節。在藥物研發時，研究者通常先用人源腫瘤細胞系進行細胞增殖實驗檢測藥物抑制效果，之后再使用相同細胞系建立小鼠 CDX 模型進行體內初步驗證[4]。如Kang 等[5]為了證明其設計的雙氫青蒿素和阿霉素共給藥脂質體對耐藥結腸癌的作用就運用了此模型；同時，在研究腫瘤發生發展機制中也經常使用該模型。也有團隊將穩定表達 LncRNA-FEZF1-AS1 的細胞系接種至裸鼠皮下和靜脈，證實了 LncRNA-FEZF1-AS1 可以通過 PKM2 途徑促進結直腸腫瘤增殖和轉移[6]。CDX 小鼠模型建立方法簡單，成瘤耗時短，一般 1～2 周即可肉眼觀察到皮下結節狀突起，成瘤率高（基本為 100%）。而且在 CDX 模型中，腫瘤皮下移植瘤形態較為規則，成瘤后可以通過游標卡尺測量腫瘤長徑、短徑，計算腫瘤的質量體積，便于進行基因及藥物對瘤體增殖作用的相關研究。CDX 模型是結直腸腫瘤基礎研究中應用最為廣泛的動物模型。有相關研究[7]發現，人源腫瘤細胞系經長期體外培養后，其腫瘤細胞生物學行為及基因譜表達水平，以及腫瘤異質性都與原始腫瘤組織存在較大差異，在預測臨床藥效方面不甚理想。因此，為了避免發生上述情況發生，在模型建立之前，需要確保細胞系的來源及可靠性。
1.2 PDX 模型
近年來，在腫瘤研究中使用病例來源的移植瘤模型在學術界和工業界都備受關注，從包括結直腸癌在內的不同腫瘤類型中開發出 PDX 模型，以改進藥物開發過程。這些模型用于臨床前藥物評估，并可用于臨床結果的預測，因它們保留了腫瘤原有的異質性、微環境、分子多樣性等特征[8]，為分析腫瘤標志物、治療靶點和新型抗癌藥的發現提供了轉化機會[9]。結直腸癌 PDX 模型構造流程為：將手術獲得結直腸腫瘤組織切塊后，3 h 內將 1～2 塊組織移植至重癥聯合免疫缺陷（severe combined immune deficiency，SCID）小鼠皮下，待 SCID 小鼠成瘤后，將其安樂死獲得腫瘤，將腫瘤置于無菌磷酸鹽緩沖溶液中分為大小均一的組織塊，一般為 1～2 mm3（1 mm×1 mm×1 mm 或 1 mm×1 mm×2 mm），并立即接種至裸鼠皮下脂肪墊較厚處，待腫瘤長徑達 10 mm 后即用于后續實驗研究[10]。PDX 模型因其供體來源為臨床患者，為個體化精準醫學提供了切實可靠的模型，常用來為臨床晚期患者篩選合適的治療方案。相較于 CDX 模型，PDX 造模時動物需接受麻醉和切開皮膚處理，對實驗人員手術技能具有較高要求；患者腫瘤組織獲取較困難，經濟成本較高[11]。這些導致 PDX 模型應用受到限制。理想的替代模型應該是在保有 PDX 模型預測反應能力的同時，還能夠像細胞系一樣低成本短周期的應用。這需要科技工作者的進一步探索。
2 化學試劑誘導成瘤
長時間的化學試劑作用可以使小鼠結直腸原位成瘤，常見的方法主要有二甲肼腹腔注射法[12]、N-甲基-N-硝基-亞硝胍灌腸法和氧化偶氮甲烷-葡聚糖硫酸鈉（azoxymethane-dextran sulfate sodium，AOM-DSS）誘導法[13]。多數研究按照“四步法”來誘導結直腸癌小鼠模型，即在實驗初給予小鼠腹腔注射 AOM（10 mg/kg），間隔 1 周后給予 2.5% DSS 飲用 7 d，以后每間隔 2 周再給予 2.5% DSS 飲用 7 d，2 個循環；3 個 DSS 循環結束后即可將小鼠安樂死進行后續實驗[14]。在實驗過程中，記錄小鼠體質量、便血及糞便形狀，能夠在疾病嚴重程度方面對小鼠模型進行評價。雖然 AOM-DSS 模型誘導時間較長，使用到的化學試劑較為昂貴，但其在腸道原位模仿了炎癥誘導結直腸腫瘤的真實過程，對于研究炎癥性腸病相關結直腸腫瘤的發生進展機制及相關治療策略的研究具有重要價值[15-16]。此外，在研究結直腸腫瘤與腸道微生物、飲食、藥物間關系時，其能夠真實反映腫瘤和微生物變化，被廣泛應用于結直腸腫瘤與腸道菌群相關研究[17]；而且此模型中小鼠免疫系統健全，具有真實的腫瘤微環境，在篩選免疫治療藥物時也具有較好的說服力[18]。
3 基因工程小鼠
ApcMin/+結直腸腫瘤小鼠模型是使用載有 Cre 重組酶的腺病毒載體感染腸道組織，激活條件種系突變來實現腸道原位結直腸腺瘤形成[19]。在基礎研究中，通常研究者不具有構建此模型的基因工程技術，故此模型多購自動物模型公司，該操作方法不在此贅述。腺瘤性息肉病（adenomatous polyposis coli，APC）基因是結直腸癌抑癌基因，其主要通過編碼的 APC 蛋白作為 Wnt 信號通路的效應因子調節 β-catenin 表達從而調控細胞增殖，ApcMin 小鼠通過誘變使其 Apc 基因編碼亮氨酸的第 850 號密碼子轉變成終止密碼子，從而提前截斷蛋白，使 APC 蛋白失去抑癌作用而致結直腸腫瘤發生。故 Apc 基因突變是結直腸腫瘤的早期事件，多數 Apc 基因突變會導致結直腸腺瘤的發生，靶向 Apc 基因有助于對結直腸腫瘤癌前病變進行預防和治療干預[20-24]。同時，ApcMin/+小鼠與人類家族性多發息肉病（familial adenomatous polyposis，FAP）表現相似，是目前用于 FAP 藥物開發的理想模型[25]。ApcMin/+結直腸腫瘤小鼠模型也可見于結直腸腫瘤病因研究和治療藥物方面的相關研究[26-27]。ApcMin/+小鼠可模擬結直腸腫瘤發生的整個過程，包括腫瘤宿主的相互作用和轉移級聯，保留了小鼠真實的免疫力和腫瘤微環境。故該模型在研究腫瘤生物學和臨床前治療試驗方面具有重要應用價值。此外，科研工作者也可把臨床研究中發現的與結直腸腫瘤相關基因通過基因工程手段，如轉基因、基因編輯等方法復現在小鼠基因組上，驗證這種突變的致癌作用及機制。
4 小鼠自身腫瘤細胞移植
在腫瘤免疫學研究中，體內實驗是不可或缺的一部分，相比人體相關免疫實驗，小鼠實驗較易實施，符合倫理。常見的小鼠結直腸腫瘤細胞系有 CT-26 或者 MCA-38 細胞，將結直腸腫瘤細胞系接種至正常實驗用小鼠的皮下脂肪墊較厚處，接種的數量、方法和位置與人源結直腸腫瘤細胞系移植瘤大致相同。這種方法簡單易操作，且耗時短，約 4～5 周即可結束實驗。CT-26 腫瘤細胞具有最高的腫瘤突變荷載，Zhang 等[28]將 CT-26 細胞接種至 C57 小鼠，通過免疫檢查點抑制受體 T 細胞免疫球蛋白和免疫受體酪氨酸抑制基序結構域蛋白（TIGIT），發現可以增強自然殺傷細胞功能從而介導強大的抑癌作用。此外，此模型也可被應用于除免疫外的其他研究。Park 等[29]團隊使用此模型觀察到木瓜籽乙醇提取物對結直腸腫瘤的抑制作用。此模型將小鼠腫瘤細胞系移植到遺傳背景相同不會發生免疫排斥的其他小鼠體內，相當于自體移植，也可稱為同基因型腫瘤移植模型。移植瘤可以大量制備，荷瘤小鼠之間均一性好，故適用于研究腫瘤和免疫系統之間的相互作用及抗腫瘤免疫藥物的初步篩選。與前面所述的 CDX 模型相比，小鼠腫瘤細胞種植模型缺乏可信的免疫微環境，腫瘤細胞系也會因傳代次數過多或污染而喪失其特征，故確保腫瘤細胞的可靠性應引起研究者的重視。
5 結直腸腫瘤轉移瘤模型的建立
90% 以上結直腸癌患者死亡的原因系腫瘤轉移及其并發癥，而非原發腫瘤。結直腸腫瘤轉移無疑成為影響患者預后的主要因素，也成為結直腸腫瘤研究的主要攻克點。結直腸腫瘤轉移模型可模擬部分或全部的腫瘤轉移過程，有助于對結直腸腫瘤轉移過程的研究及抗腫瘤轉移藥效的評估[30]。結直腸腫瘤常見轉移部位有肝、肺、腹腔種植，終末期可發生腦和骨轉移[31]。現就此作一詳細介紹。
5.1 結直腸癌肝轉移模型
結直腸癌肝轉移模型分為自發性結直腸癌肝轉移小鼠模型和實驗性結直腸癌肝轉移小鼠模型。前者是將結直腸癌細胞系或組織種植在免疫缺陷小鼠結腸或直腸壁黏膜層，使其生成原位腫瘤，之后發生肝轉移，該過程還原了從結直腸癌發生直至肝轉移的整個過程，耗時較長[32]。而實驗性結直腸癌肝轉移小鼠模型是將結直腸腫瘤細胞系注射在免疫缺陷小鼠脾臟后，結直腸腫瘤細胞通過血液循環轉移到肝臟，該模型還原了臨床中腫瘤切除術后癌細胞回流入門靜脈至肝臟時的血道播散而發生肝轉移的過程，腫瘤轉移率較高，成為研究結直腸癌肝轉移機制和抗轉移治療的常用模型[33]。
5.2 結直腸癌肺轉移模型
臨床上，在轉移性結直腸腫瘤患者中，肝肺同時轉移的患者并不少見[34]。同樣，在實驗中，結直腸癌肝轉移動物模型可自行發生進展為肺轉移，還原了臨床上結直腸癌肝轉移后，腫瘤細胞經血行轉移發生遠處肺轉移的過程，然而，此過程發生較為緩慢。而尾靜脈注射法是將結直腸腫瘤細胞系經小鼠尾靜脈注射后，癌細胞通過肺部的毛細血管網進入動脈血液循環系統，可造成全身多發轉移灶，由于腫瘤細胞較為黏稠、易聚團，易于黏附在小鼠肺部微血管，主要形成肺轉移，是結直腸癌肺轉移模型中最常見的造模方法[35]。
5.3 結直腸癌腹腔種植模型的建立
結直腸癌腹腔種植轉移，是將結直腸癌細胞系（人源或鼠源）在裸鼠或正常小鼠上進行腹腔注射，使結直腸癌細胞系能夠在腹腔內擴散生長。約 10 d 后即可在腹腔觀察到腫瘤結節，模擬了外科術后結直腸癌腹腔種植擴散和終末期患者腹腔廣泛轉移的病理生理過程。對終末期轉移性結直腸癌的研究具有很大幫助[36]。
5.4 結直腸癌腦和骨轉移模型建立
將結直腸腫瘤細胞系經左心室注射，使其進入小鼠體循環，之后結直腸腫瘤細胞經過黏附、降解、遷移等過程，發生腦和骨骼轉移，可很好地模擬結直腸腫瘤細胞經過血道遠處轉移至骨和腦的過程[37]。
轉移瘤模型對手術操作要求較高，使用影像學技術判斷轉移瘤模型建立是否成功十分重要。因此有團隊采用裸鼠直腸黏膜下注射紅色熒光蛋白標記的人結直腸腺癌細胞系 HCT-116 建立原位移植瘤模型，并借助活體成像系統在不同時間點采集熒光信號圖像，實時觀察癌細胞在裸鼠直腸的生長和轉移情況[38]。以上轉移瘤模型，在保證細胞系來源可靠性的情況下，為針對結直腸癌遠處轉移機制及相關臨床藥物的研發做出了巨大貢獻。結直腸腫瘤常見小鼠模型優缺點見表 1。
表1
結直腸腫瘤常見小鼠模型優缺點匯總
6 展望
綜上所述，在需要體內造模時，研究者應根據其課題需要，在閱讀大量相關文獻實驗方法和材料的基礎上進行選擇，在這些結直腸腫瘤模型中，每個模型都有其優缺點。在使用小鼠種類方面，有正常小鼠及免疫缺陷小鼠（裸鼠）；從腫瘤來源方面，有人源、鼠源結直腸癌細胞系及結直腸腫瘤組織移植；從腫瘤位置來看，有結直腸原位、皮下種植及肝肺等器官的轉移。只有深入閱讀和思考這些模型的流程和特點，才能為科研人員后期的體內模型選擇提供正確的方向，從而讓實驗結果更具說服力。同時，既往可見將兩種模型同時應用于研究之中[39]，這極大地增加了研究的可信度。
結直腸癌的病因及發病機制十分復雜，目前廣泛使用的動物模型都有其優缺點及適用范圍，構造理想的動物模型是對結直腸癌深入研究的重要工具。因筆者閱讀文獻有限及研究技術的飛速發展，并未能將所有模型一一闡述。隨著結直腸腫瘤研究的不斷發展和深入，新的結直腸腫瘤相關模型層出不窮，如黃曉東團隊[40]利用基因工程技術，構建了 ApcloxP/loxP+KrasLSL- Gl2D/-雙轉基因的結直腸腫瘤模型小鼠，成瘤率達到 40%。可見時刻關注最新研究方法和進展對于科研工作者十分重要。筆者對動物模型的總結如下：時刻關注最新方法，選擇合適的模型類型，設置合理的預實驗，增強動手能力，形成團隊方法體系，一定能為研究結果增光添彩。
重要聲明
利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：張宇坤：醞釀和設計、起草文章；胡漢卿：批評性審閱；盛祥宗：批評性審閱；吳宏宇：批評性審閱；王貴玉，張騫：批評性審閱、指導、支持性貢獻。
