引用本文： 謝曉然, 鮑文華, 楊澤. 腫瘤壞死因子-α 基因多態性與黑龍江省東部地區慢性阻塞性肺疾病人群易感性的研究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2019, 18(3): 217-223. doi: 10.7507/1671-6205.201711001 復制
慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）是全球高致死率、高致殘率、高患病率的慢性疾病之一[1]。2017 年慢性阻塞性肺疾病全球倡議（GOLD）將慢阻肺定義為一種可防可治的常見疾病，其特征是持續存在的氣流受限和呼吸道癥狀，且常呈進展性，與有害顆粒或氣體暴露導致的氣道慢性炎癥和（或）肺泡異常有關[2]。吸煙被認為是慢阻肺發生過程中的主要危險因子，但只有 10%～20% 的吸煙人群發展為慢阻肺[3]，而慢阻肺患者中無吸煙史者也占了相當大比例[4]，表明慢阻肺發生發展過程中仍有其他因素的參與[5-7]。研究表明，導致人群肺功能下降的原因中吸煙僅占 15%，包括環境因素的其他因素占 30%，遺傳因素占 55%[8-9]，而慢阻肺與反復發作的炎癥反應密切相關[10]。因此，世界各地的研究者們將目光投向了可以反映炎癥水平的生物標志物及其與慢阻肺臨床分期的關系上。已經證實有關的標志物有白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、IL-8 以及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α 等。TNF-α 是由巨噬細胞 β 單核細胞活化產生的一種可以引發瀑布式炎癥反應的細胞因子[11]，在慢阻肺患者的痰液、血液、肺泡灌洗液、肺活檢標本中均可發現升高[12-14]。而且，國外學者在一項以慢阻肺大鼠為模型的研究中發現，在大鼠肺泡壁和氣道肺泡表面活性蛋白 C 生成細胞中表現出 TNF-α 和某些金屬蛋白酶的過表達[15]，提示有 TNF-α 相關基因的參與。人 TNF-α 基因位于 6 號染色體 p21.1-p21.3 區域，由 3 個內含子和 2 個外顯子組成。目前已發現其與慢阻肺有關的基因多態位點有–308G/A、–238G/A、–863C/A、+489G/A 等[16-18]。但針對 TNF-α 基因多態性與慢阻肺發病風險的關系，在不同種族群體、性別、年齡等中進行的研究結論不盡一致，甚至出現矛盾的結果。為了進一步探討 TNF-α 與慢阻肺易感性的關系，本研究采用病例對照的研究方法，綜合分析 TNF-α 的多態位點是否與慢阻肺的發病有關。
1 資料與方法
1.1 一般資料
1.1.1 研究對象
選取 2016 年 1 月至 2017 年 1 月在佳木斯大學附屬第一醫院呼吸內科住院、門診確診的慢阻肺患者 347 例為病例組，男 172 例，女 168 例，平均年齡（63.7±11.7）歲。隨機選擇同期本院體檢中心的健康體檢人群 338 例作為對照組，男 171 例，女 167 例，平均年齡（60.8±12.5）歲。其中病例組患者再按照中華醫學會呼吸分會慢性阻塞性肺疾病學組修訂的《慢性阻塞性肺疾病治療指南》[19]（2016 年）嚴重程度的分級標準分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級。入組者均為黑龍江東部地區常住居民，相互之間均無血緣關系，均簽署知情同意。該研究經佳木斯大學附屬第一醫院、北京醫院倫理委員會批準。
1.1.2 納入標準
（1）慢性支氣管炎癥狀及病史；（2）肺氣腫體征；（3）使用支氣管舒張劑后第 1 秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in 1 second，FEV1）/用力肺活量（forced vital capacity，FVC）<70%。均符合 2017 年 GOLD 指南中慢阻肺的診斷標準[2]和慢阻肺急性加重診治專家共識[20]（2014 年版）。
1.1.3 排除標準
同時合并有支氣管擴張、哮喘、肺囊性纖維化、間質性肺纖維化、活動性肺結核或肺外結核以及其他重要肺部疾病；其他進展性全身性或慢性致命性疾病，包括心血管、神經、內分泌、血液、肝腎疾病或惡性腫瘤。
1.2 方法
1.2.1 肺功能檢測
采用德國公司 JAEGER 肺功能檢測儀。測定前靜坐 10 min 測定過程中保持坐位，測定 FEV1 占預計值百分比（FEV1%pred）、FEV1/FVC，以 3 次測定值中最高值作為最終肺功能測定值。
1.2.2 采血
入選者于清晨空腹狀態下采取靜脈全血 3 ml，置于抗凝管，盡快轉移至 –80 ℃ 超低溫冰箱中凍存。
1.2.3 基因組 DNA 提取
采用 TIANGEN 血液基因組 DNA 提取試劑盒（離心柱型，目錄號 DP348，北京天根生化科技有限公司）提取 DNA，嚴格按照說明書操作。具體步驟為：充分混勻血樣，加入 CL 裂解紅細胞，混勻后 8 000 r/mim 離心 5 min，倒掉上清，加入 Buffer GS 震蕩至徹底混勻，再加入 Buffer GB 和蛋白酶 K 裂解白細胞，放入 60 ℃ 烘箱 60 min，期間顛倒混勻數次，之后加入 Buffer BD 充分混勻后裝入吸附柱 12 000 r/mim 離心 30 s，倒掉廢液加入 Buffer GDB 洗滌、Buffer PWB 洗滌，晾干洗滌液后將離心柱轉移至無菌離心管，加 100 μl 超純水洗脫 DNA，12 000 r/mim 離心 2 min 收集 DNA。使用 Nano Drop 系統（Thermo Scientific，Wilming，DE，美國）通過紫外線吸收分光光度法在 260 nm 波長下定量 DNA。
1.2.4 引物的設計與選擇
通過查閱相關文獻得到目的基因編號，使用 National Center for Biotechnology Information（NCBI）數據庫得到目的基因序列，取目的位點上游 40 bp，下游 40 bp 使用 Primer 3（Version 4.0）或 NCBI 中 Primer-BLAST tool 設計引物，規定產物長度 40～70 bp，遵循引物設計原則：引物長度 18～27 bp，GC%：40%～60%，退火溫度 60 ℃ 左右，上下游 GC 含量保持接近，不引起二聚體和發卡結構。設計好的引物通過 University of California Santa Cruz（UCSC）數據庫中 In-silico PCR tool 進行特異性檢驗。所設計引物由北京擎科生物有限公司合成（表 1）。
表1
TNF-α 多態性信息及引物
1.2.5 基因片段的擴增
采用 Bio-Rad CFX 96 實時 PCR system（Bio-Rad，USA）聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）進行擴增，建立 PCR 反應體系（10 μl）：2×PCR Super Mix 5.0 μl；超純水 2.8 μl；LC Green 飽和熒光染料（北京思博全科技有限公司）0.8 μl；內參（上海生工生物工程股份有限公司）0.2 μl；引物，GF 0.1 μl，GR 0.1 μl；DNA 稀釋液（取 1 ml/C μl DNA 原液，加超純水補足至 50 μl）。反應條件：95 ℃ 預變性 3 min，95 ℃ 變性 30s，在各自的退火溫度下退火 20 s，72 ℃ 延伸 30 s，共 45 個循環，72 ℃ 終末延伸 5 min。
1.2.6 基因分型
采用 Light Scanner96 高分辨熔解曲線突變檢測系統 HRM（Idaho，USA）進行數據分析，對樣本進行分型，并根據熔解順序確定基因型。高分辨溶解范圍 70～85 ℃，每次升溫 0.1 ℃，維持 2 s，HRM 通過自動采集數據并自動執行增益校正。
1.2.7 PCR 產物直接測序法驗證
將擴增好的產物送往北京擎科生物有限公司進行 DNA 序列測定。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 20.0 統計軟件。直接計算法計算等位基因及基因型頻率，計量資料用均數±標準差（
±s）表示。各組間不同指標差異采用單因素方差分析。兩組肺功能比較，符合正態分布采用兩獨立樣本 t 檢驗，不符合采用秩合檢驗，多組肺功能均數兩兩比較，方差齊性時采用 LSD 檢驗，方差不齊采用 Dunnett’ s T（3） 檢驗。兩組基因型頻率比較采用獨立樣本 χ2 檢驗，三組間比較采用 2×C 列聯表 χ2 檢驗。其中，共顯性模型為 AA、AG、GG 三者比較，顯性模型為 GG 與（AA+AG）的比較，隱性模型為 AA 與（AG+GG）的比較，超顯性模型為 AG 與（AA+GG）的比較（–863 位點的突變為 C/A，其模型比較為 AA、AC、CC 的比較）。兩組樣本與基因遺傳平衡定律（Hardy-Weinberg 平衡）的符合程度用 χ2 檢驗分析。多個分類變量因素應用 logistics 回歸分析。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 病例組與對照組間一般情況比較
兩組研究對象性別、年齡差異不具有統計學意義（P>0.05），但吸煙史差異有統計學意義（P<0.05），結果見表 2。吸煙分層分析結果無統計學意義（P>0.05）。
表2
研究人群的基線資料
2.2 遺傳平衡定律檢驗
TNF-α 基因 –308G/A、–238G/A、–863C/A、–850G/A、+489G/A 各基因型進行軟件分析，對照組樣本中 –308G/A、–238G/A、+489G/A、–850G/A 均符合 Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律（P>0.05），表明本研究樣本群體具有較好的遺傳代表性，–863C/A 不符合 Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律（P<0.05），可能該位點發生基因突變或基因遷入。結果見表 3。
表3
對照組 Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗
2.3 兩組 TNF-α 多態位點基因型頻率、等位基因頻率比較
兩組人群中 rs1800629（–308G/A）、rs1800610（+489G/A）、rs1799724（–850G/A）檢出 AA、AG、GG 三種基因型，rs1800630（–863C/A）檢出 AA、AC、CC 三種基因型，rs361525（–238G/A）只檢出 GG 一種基因型，未檢測出突變基因。建立各位點基因模型，其中 –238G/A、–863C/A、+489G/A 位點基因型在病例組和對照組中的分布頻率，差異無統計學意義（P>0.05）；–308G/A 共顯性模型和隱性模型在兩組間差異有統計學意義（共顯性 P=0.036，OR 1.512，95%CI 1.023～2.234）；隱性 P=0.027，OR 1.202，95%CI 1.024～1.741）；–850G/A 共顯性模型、顯性模型和超顯性模型在兩組間差異均有統計學意義（共顯性 P=0.000，OR 1.781，95%CI 1.363～2.329；顯性 P=0.000，OR 0.391 7，95%CI 0.270～0.568；超顯性 P=0.000，OR 2.680，95%CI 1.728～4.156）。結果見表 4。
表4
慢阻肺組和對照組 TNF-α 單核苷酸多態性的基因型頻率
TNF-α –238、–863、+489 位點等位基因頻率在病例組和對照組之間比較差異無統計學意義（P>0.05），–308、–850 等位基因頻率病例組和對照組之間差異有統計學意義（–308 位點 P=0.036，OR 1.51，95%CI 1.02～2.23；–850 位點 P=0.000，OR 2.19，95%CI 1.61～2.98）。結果見表 5。
表5
慢阻肺組和對照組 TNF-α 單核苷酸多態性的等位基因頻率比較
2.4 遺傳不平衡單倍型分析結果
TNF-α –863、+489、–308、–850 位點進入遺傳不平衡單倍型分析。連鎖不平衡測試結果顯示–308G/A、–863C/A、+489G/A、–850G/A 位點總體之間不存在連鎖關系，即趨于遺傳平衡，單倍型分析及單倍體基因型分析結果顯示+489、–308、–850 位點分別為 A、G、A 時有統計學意義（P<0.05，OR>1，95%CI >1）。結果見表 6、7。
表6
慢阻肺組和對照組各位點單倍型分析
表7
慢阻肺組和對照組各位點單倍體基因型分析
2.5 慢阻肺組基因多態與肺功能分級關系
病例組中按照肺功能分級相比較，–308G/A、–863C/A 位點突變基因組與野生型肺功能差異有統計學意義（P=0.038，P=0.020），+489G/A、–850G/A 位點突變基因與野生型肺功能差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表 8。
表8
病例組基因型表型與肺功能分級關系分析
3 討論
慢阻肺的病理基礎是持續的炎癥導致小氣道狹窄、肺泡壁損傷以及肺實質降解和結構破壞。TNF-α 是人體內最主要的炎癥因子之一，能誘導其他介質發生瀑布式聚集反應。肺組織內炎癥介質長期聚集形成的慢性黏液高分泌狀態，可直接破壞肺結締組織，同時高密度的黏液可使氣道黏液栓形成、肺泡彈力受限，小氣道炎癥加劇會使纖維組織形成從而導致氣道重塑，氣道阻力增大，肺彈性減弱，持續性氣流受限而發展為慢阻肺。大量臨床研究已表明慢阻肺患者痰液及循環血中均可檢測出 TNF-α 水平增高[12-14]，提示 TNF-α 確實在慢阻肺發生發展中起到重要的作用。
本研究中慢阻肺患者診斷確實，均符合國際公認的診斷標準[2, 17]。研究結果中顯示吸煙史差異在慢阻肺病例組和對照組中統計學意義，說明吸煙是慢阻肺發生發展的主要危險因素之一。但再根據吸煙情況進行分層分析時，發現吸煙人群的 TNF-α 多態性與慢阻肺發病并無顯著相關性，表明吸煙狀況可能不會影響 TNF-α 多態與慢阻肺易感性。本研究基因分型采用 HRM 分析，相較于傳統單核苷酸多態性分型方法，HRM 分析不受突變堿基位點及突變類型的影響，且不需要特異序列的探針，操作簡便快速，研究結果準確可信。在基因表型和等位基因頻率分析中，本研究顯示 TNF-α –308 位點共顯性模型和隱性模型在病例組和對照組間有統計學差異，OR>1，95%CI >1，提示–308 位點上 AA 基因型可能是慢阻肺的危險因素，AA 純合子基因型患者發病率風險較高。–308 位點等位基因頻率與慢阻肺發病顯著相關，OR>1，95%CI >1，說明 A 等位基因是慢阻肺的危險因素，這與上述基因表型概率所提示結果一致，也與 Sakao 等[21]在日本人群、Huang 等[22]在中國臺灣人群和 Ozdogan 等[23]在土耳其人群中的研究結果一致。–863、–238、+489 位點等位基因頻率與慢阻肺發病均無顯著相關，這與 Teramoto 等[24]、Gingo 等[25]研究結果相似，但 Cui 等[18]、Chiang 等[26]、Kü?ükaycan 等[27]均發現這些位點可能與慢阻肺的發病有關，提示這些位點在不同人群中對慢阻肺的影響或許有不同，可能與人種、民族、或地域、生活差異等有關。單倍型分析結果顯示當 +489、–308、–850 分別為 A、G、A 時病例組與對照組差異顯著，OR<1，95%CI <1，提示 AGA 連鎖遺傳可能是慢阻肺的危險因素，此三位點基因型為 AGA 的患者發病風險較高。病例組按肺功能分級比較結果中，–308、–863 位點多態性與肺功能差異有顯著相關性，+489 位點無相關性，提示 –308 中 A 等位基因、–863 中 A 等位基因與慢阻肺肺功能惡化有關，此二位點含 A 等位基因的慢阻肺患者肺功能下降速率更快、疾病更易惡化。本研究人群中 TNF-α –238 基因只檢出 G 位點，未發現多態性。
黑龍江省是我國慢阻肺高發地區之一，這可能與黑龍江省地處高緯度寒冷地區有關（北緯 43°25’至北緯 53°33’），長期吸入寒冷空氣刺激氣道誘發氣道炎癥反應最終引發慢阻肺。本研究中 Hard-Weinberg 遺傳平衡檢驗顯示 TNF-α –308、–238、+489、–850 均符合遺傳平衡，表示此四個位點的對照研究樣本具有較好的遺傳代表性。–863 位點不符合遺傳平衡，可能與 300 年前中國歷史上最大規模的人口遷移—闖關東有關，后續研究進一步擴大樣本以減小其影響。
綜上所述，在黑龍江省東部地區人群中，TNF-α –308 位點上 A 等位基因可能是慢阻肺的危險因素，AA 純合子基因型患者發病率風險較高。–850 位點 G 等位基因可能是慢阻肺的危險因素。當+489、–308、–850 分別為 A、G、A 時可能是慢阻肺的危險因素，此三位點基因型為 AGA 的患者發病風險較高。TNF-α –308 中 A 等位基因、–863 中 A 等位基因與慢阻肺肺功能惡化有關，此二位點含 A 等位基因的慢阻肺患者肺功能下降速率更高、更易惡化。本研究未發現 TNF-α –238 多態位點與慢阻肺相關性，這有待于擴大樣本量及不同人群進一步研究兩者是否關聯。
慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）是全球高致死率、高致殘率、高患病率的慢性疾病之一[1]。2017 年慢性阻塞性肺疾病全球倡議（GOLD）將慢阻肺定義為一種可防可治的常見疾病，其特征是持續存在的氣流受限和呼吸道癥狀，且常呈進展性，與有害顆粒或氣體暴露導致的氣道慢性炎癥和（或）肺泡異常有關[2]。吸煙被認為是慢阻肺發生過程中的主要危險因子，但只有 10%～20% 的吸煙人群發展為慢阻肺[3]，而慢阻肺患者中無吸煙史者也占了相當大比例[4]，表明慢阻肺發生發展過程中仍有其他因素的參與[5-7]。研究表明，導致人群肺功能下降的原因中吸煙僅占 15%，包括環境因素的其他因素占 30%，遺傳因素占 55%[8-9]，而慢阻肺與反復發作的炎癥反應密切相關[10]。因此，世界各地的研究者們將目光投向了可以反映炎癥水平的生物標志物及其與慢阻肺臨床分期的關系上。已經證實有關的標志物有白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、IL-8 以及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α 等。TNF-α 是由巨噬細胞 β 單核細胞活化產生的一種可以引發瀑布式炎癥反應的細胞因子[11]，在慢阻肺患者的痰液、血液、肺泡灌洗液、肺活檢標本中均可發現升高[12-14]。而且，國外學者在一項以慢阻肺大鼠為模型的研究中發現，在大鼠肺泡壁和氣道肺泡表面活性蛋白 C 生成細胞中表現出 TNF-α 和某些金屬蛋白酶的過表達[15]，提示有 TNF-α 相關基因的參與。人 TNF-α 基因位于 6 號染色體 p21.1-p21.3 區域，由 3 個內含子和 2 個外顯子組成。目前已發現其與慢阻肺有關的基因多態位點有–308G/A、–238G/A、–863C/A、+489G/A 等[16-18]。但針對 TNF-α 基因多態性與慢阻肺發病風險的關系，在不同種族群體、性別、年齡等中進行的研究結論不盡一致，甚至出現矛盾的結果。為了進一步探討 TNF-α 與慢阻肺易感性的關系，本研究采用病例對照的研究方法，綜合分析 TNF-α 的多態位點是否與慢阻肺的發病有關。
1 資料與方法
1.1 一般資料
1.1.1 研究對象
選取 2016 年 1 月至 2017 年 1 月在佳木斯大學附屬第一醫院呼吸內科住院、門診確診的慢阻肺患者 347 例為病例組，男 172 例，女 168 例，平均年齡（63.7±11.7）歲。隨機選擇同期本院體檢中心的健康體檢人群 338 例作為對照組，男 171 例，女 167 例，平均年齡（60.8±12.5）歲。其中病例組患者再按照中華醫學會呼吸分會慢性阻塞性肺疾病學組修訂的《慢性阻塞性肺疾病治療指南》[19]（2016 年）嚴重程度的分級標準分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級。入組者均為黑龍江東部地區常住居民，相互之間均無血緣關系，均簽署知情同意。該研究經佳木斯大學附屬第一醫院、北京醫院倫理委員會批準。
1.1.2 納入標準
（1）慢性支氣管炎癥狀及病史；（2）肺氣腫體征；（3）使用支氣管舒張劑后第 1 秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in 1 second，FEV1）/用力肺活量（forced vital capacity，FVC）<70%。均符合 2017 年 GOLD 指南中慢阻肺的診斷標準[2]和慢阻肺急性加重診治專家共識[20]（2014 年版）。
1.1.3 排除標準
同時合并有支氣管擴張、哮喘、肺囊性纖維化、間質性肺纖維化、活動性肺結核或肺外結核以及其他重要肺部疾病；其他進展性全身性或慢性致命性疾病，包括心血管、神經、內分泌、血液、肝腎疾病或惡性腫瘤。
1.2 方法
1.2.1 肺功能檢測
采用德國公司 JAEGER 肺功能檢測儀。測定前靜坐 10 min 測定過程中保持坐位，測定 FEV1 占預計值百分比（FEV1%pred）、FEV1/FVC，以 3 次測定值中最高值作為最終肺功能測定值。
1.2.2 采血
入選者于清晨空腹狀態下采取靜脈全血 3 ml，置于抗凝管，盡快轉移至 –80 ℃ 超低溫冰箱中凍存。
1.2.3 基因組 DNA 提取
采用 TIANGEN 血液基因組 DNA 提取試劑盒（離心柱型，目錄號 DP348，北京天根生化科技有限公司）提取 DNA，嚴格按照說明書操作。具體步驟為：充分混勻血樣，加入 CL 裂解紅細胞，混勻后 8 000 r/mim 離心 5 min，倒掉上清，加入 Buffer GS 震蕩至徹底混勻，再加入 Buffer GB 和蛋白酶 K 裂解白細胞，放入 60 ℃ 烘箱 60 min，期間顛倒混勻數次，之后加入 Buffer BD 充分混勻后裝入吸附柱 12 000 r/mim 離心 30 s，倒掉廢液加入 Buffer GDB 洗滌、Buffer PWB 洗滌，晾干洗滌液后將離心柱轉移至無菌離心管，加 100 μl 超純水洗脫 DNA，12 000 r/mim 離心 2 min 收集 DNA。使用 Nano Drop 系統（Thermo Scientific，Wilming，DE，美國）通過紫外線吸收分光光度法在 260 nm 波長下定量 DNA。
1.2.4 引物的設計與選擇
通過查閱相關文獻得到目的基因編號，使用 National Center for Biotechnology Information（NCBI）數據庫得到目的基因序列，取目的位點上游 40 bp，下游 40 bp 使用 Primer 3（Version 4.0）或 NCBI 中 Primer-BLAST tool 設計引物，規定產物長度 40～70 bp，遵循引物設計原則：引物長度 18～27 bp，GC%：40%～60%，退火溫度 60 ℃ 左右，上下游 GC 含量保持接近，不引起二聚體和發卡結構。設計好的引物通過 University of California Santa Cruz（UCSC）數據庫中 In-silico PCR tool 進行特異性檢驗。所設計引物由北京擎科生物有限公司合成（表 1）。
表1
TNF-α 多態性信息及引物
1.2.5 基因片段的擴增
采用 Bio-Rad CFX 96 實時 PCR system（Bio-Rad，USA）聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）進行擴增，建立 PCR 反應體系（10 μl）：2×PCR Super Mix 5.0 μl；超純水 2.8 μl；LC Green 飽和熒光染料（北京思博全科技有限公司）0.8 μl；內參（上海生工生物工程股份有限公司）0.2 μl；引物，GF 0.1 μl，GR 0.1 μl；DNA 稀釋液（取 1 ml/C μl DNA 原液，加超純水補足至 50 μl）。反應條件：95 ℃ 預變性 3 min，95 ℃ 變性 30s，在各自的退火溫度下退火 20 s，72 ℃ 延伸 30 s，共 45 個循環，72 ℃ 終末延伸 5 min。
1.2.6 基因分型
采用 Light Scanner96 高分辨熔解曲線突變檢測系統 HRM（Idaho，USA）進行數據分析，對樣本進行分型，并根據熔解順序確定基因型。高分辨溶解范圍 70～85 ℃，每次升溫 0.1 ℃，維持 2 s，HRM 通過自動采集數據并自動執行增益校正。
1.2.7 PCR 產物直接測序法驗證
將擴增好的產物送往北京擎科生物有限公司進行 DNA 序列測定。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 20.0 統計軟件。直接計算法計算等位基因及基因型頻率，計量資料用均數±標準差（±s）表示。各組間不同指標差異采用單因素方差分析。兩組肺功能比較，符合正態分布采用兩獨立樣本 t 檢驗，不符合采用秩合檢驗，多組肺功能均數兩兩比較，方差齊性時采用 LSD 檢驗，方差不齊采用 Dunnett’ s T（3） 檢驗。兩組基因型頻率比較采用獨立樣本 χ2 檢驗，三組間比較采用 2×C 列聯表 χ2 檢驗。其中，共顯性模型為 AA、AG、GG 三者比較，顯性模型為 GG 與（AA+AG）的比較，隱性模型為 AA 與（AG+GG）的比較，超顯性模型為 AG 與（AA+GG）的比較（–863 位點的突變為 C/A，其模型比較為 AA、AC、CC 的比較）。兩組樣本與基因遺傳平衡定律（Hardy-Weinberg 平衡）的符合程度用 χ2 檢驗分析。多個分類變量因素應用 logistics 回歸分析。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 病例組與對照組間一般情況比較
兩組研究對象性別、年齡差異不具有統計學意義（P>0.05），但吸煙史差異有統計學意義（P<0.05），結果見表 2。吸煙分層分析結果無統計學意義（P>0.05）。
表2
研究人群的基線資料
2.2 遺傳平衡定律檢驗
TNF-α 基因 –308G/A、–238G/A、–863C/A、–850G/A、+489G/A 各基因型進行軟件分析，對照組樣本中 –308G/A、–238G/A、+489G/A、–850G/A 均符合 Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律（P>0.05），表明本研究樣本群體具有較好的遺傳代表性，–863C/A 不符合 Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律（P<0.05），可能該位點發生基因突變或基因遷入。結果見表 3。
表3
對照組 Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗
2.3 兩組 TNF-α 多態位點基因型頻率、等位基因頻率比較
兩組人群中 rs1800629（–308G/A）、rs1800610（+489G/A）、rs1799724（–850G/A）檢出 AA、AG、GG 三種基因型，rs1800630（–863C/A）檢出 AA、AC、CC 三種基因型，rs361525（–238G/A）只檢出 GG 一種基因型，未檢測出突變基因。建立各位點基因模型，其中 –238G/A、–863C/A、+489G/A 位點基因型在病例組和對照組中的分布頻率，差異無統計學意義（P>0.05）；–308G/A 共顯性模型和隱性模型在兩組間差異有統計學意義（共顯性 P=0.036，OR 1.512，95%CI 1.023～2.234）；隱性 P=0.027，OR 1.202，95%CI 1.024～1.741）；–850G/A 共顯性模型、顯性模型和超顯性模型在兩組間差異均有統計學意義（共顯性 P=0.000，OR 1.781，95%CI 1.363～2.329；顯性 P=0.000，OR 0.391 7，95%CI 0.270～0.568；超顯性 P=0.000，OR 2.680，95%CI 1.728～4.156）。結果見表 4。
表4
慢阻肺組和對照組 TNF-α 單核苷酸多態性的基因型頻率
TNF-α –238、–863、+489 位點等位基因頻率在病例組和對照組之間比較差異無統計學意義（P>0.05），–308、–850 等位基因頻率病例組和對照組之間差異有統計學意義（–308 位點 P=0.036，OR 1.51，95%CI 1.02～2.23；–850 位點 P=0.000，OR 2.19，95%CI 1.61～2.98）。結果見表 5。
表5
慢阻肺組和對照組 TNF-α 單核苷酸多態性的等位基因頻率比較
2.4 遺傳不平衡單倍型分析結果
TNF-α –863、+489、–308、–850 位點進入遺傳不平衡單倍型分析。連鎖不平衡測試結果顯示–308G/A、–863C/A、+489G/A、–850G/A 位點總體之間不存在連鎖關系，即趨于遺傳平衡，單倍型分析及單倍體基因型分析結果顯示+489、–308、–850 位點分別為 A、G、A 時有統計學意義（P<0.05，OR>1，95%CI >1）。結果見表 6、7。
表6
慢阻肺組和對照組各位點單倍型分析
表7
慢阻肺組和對照組各位點單倍體基因型分析
2.5 慢阻肺組基因多態與肺功能分級關系
病例組中按照肺功能分級相比較，–308G/A、–863C/A 位點突變基因組與野生型肺功能差異有統計學意義（P=0.038，P=0.020），+489G/A、–850G/A 位點突變基因與野生型肺功能差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表 8。
表8
病例組基因型表型與肺功能分級關系分析
3 討論
慢阻肺的病理基礎是持續的炎癥導致小氣道狹窄、肺泡壁損傷以及肺實質降解和結構破壞。TNF-α 是人體內最主要的炎癥因子之一，能誘導其他介質發生瀑布式聚集反應。肺組織內炎癥介質長期聚集形成的慢性黏液高分泌狀態，可直接破壞肺結締組織，同時高密度的黏液可使氣道黏液栓形成、肺泡彈力受限，小氣道炎癥加劇會使纖維組織形成從而導致氣道重塑，氣道阻力增大，肺彈性減弱，持續性氣流受限而發展為慢阻肺。大量臨床研究已表明慢阻肺患者痰液及循環血中均可檢測出 TNF-α 水平增高[12-14]，提示 TNF-α 確實在慢阻肺發生發展中起到重要的作用。
本研究中慢阻肺患者診斷確實，均符合國際公認的診斷標準[2, 17]。研究結果中顯示吸煙史差異在慢阻肺病例組和對照組中統計學意義，說明吸煙是慢阻肺發生發展的主要危險因素之一。但再根據吸煙情況進行分層分析時，發現吸煙人群的 TNF-α 多態性與慢阻肺發病并無顯著相關性，表明吸煙狀況可能不會影響 TNF-α 多態與慢阻肺易感性。本研究基因分型采用 HRM 分析，相較于傳統單核苷酸多態性分型方法，HRM 分析不受突變堿基位點及突變類型的影響，且不需要特異序列的探針，操作簡便快速，研究結果準確可信。在基因表型和等位基因頻率分析中，本研究顯示 TNF-α –308 位點共顯性模型和隱性模型在病例組和對照組間有統計學差異，OR>1，95%CI >1，提示–308 位點上 AA 基因型可能是慢阻肺的危險因素，AA 純合子基因型患者發病率風險較高。–308 位點等位基因頻率與慢阻肺發病顯著相關，OR>1，95%CI >1，說明 A 等位基因是慢阻肺的危險因素，這與上述基因表型概率所提示結果一致，也與 Sakao 等[21]在日本人群、Huang 等[22]在中國臺灣人群和 Ozdogan 等[23]在土耳其人群中的研究結果一致。–863、–238、+489 位點等位基因頻率與慢阻肺發病均無顯著相關，這與 Teramoto 等[24]、Gingo 等[25]研究結果相似，但 Cui 等[18]、Chiang 等[26]、Kü?ükaycan 等[27]均發現這些位點可能與慢阻肺的發病有關，提示這些位點在不同人群中對慢阻肺的影響或許有不同，可能與人種、民族、或地域、生活差異等有關。單倍型分析結果顯示當 +489、–308、–850 分別為 A、G、A 時病例組與對照組差異顯著，OR<1，95%CI <1，提示 AGA 連鎖遺傳可能是慢阻肺的危險因素，此三位點基因型為 AGA 的患者發病風險較高。病例組按肺功能分級比較結果中，–308、–863 位點多態性與肺功能差異有顯著相關性，+489 位點無相關性，提示 –308 中 A 等位基因、–863 中 A 等位基因與慢阻肺肺功能惡化有關，此二位點含 A 等位基因的慢阻肺患者肺功能下降速率更快、疾病更易惡化。本研究人群中 TNF-α –238 基因只檢出 G 位點，未發現多態性。
黑龍江省是我國慢阻肺高發地區之一，這可能與黑龍江省地處高緯度寒冷地區有關（北緯 43°25’至北緯 53°33’），長期吸入寒冷空氣刺激氣道誘發氣道炎癥反應最終引發慢阻肺。本研究中 Hard-Weinberg 遺傳平衡檢驗顯示 TNF-α –308、–238、+489、–850 均符合遺傳平衡，表示此四個位點的對照研究樣本具有較好的遺傳代表性。–863 位點不符合遺傳平衡，可能與 300 年前中國歷史上最大規模的人口遷移—闖關東有關，后續研究進一步擴大樣本以減小其影響。
綜上所述，在黑龍江省東部地區人群中，TNF-α –308 位點上 A 等位基因可能是慢阻肺的危險因素，AA 純合子基因型患者發病率風險較高。–850 位點 G 等位基因可能是慢阻肺的危險因素。當+489、–308、–850 分別為 A、G、A 時可能是慢阻肺的危險因素，此三位點基因型為 AGA 的患者發病風險較高。TNF-α –308 中 A 等位基因、–863 中 A 等位基因與慢阻肺肺功能惡化有關，此二位點含 A 等位基因的慢阻肺患者肺功能下降速率更高、更易惡化。本研究未發現 TNF-α –238 多態位點與慢阻肺相關性，這有待于擴大樣本量及不同人群進一步研究兩者是否關聯。
