引用本文： 王翠, 李姣, 魯凌云, 劉璐, 余希杰. 石膽酸對于BMSCs成骨-成脂分化平衡的影響. 中國修復重建外科雜志, 2024, 38(1): 82-90. doi: 10.7507/1002-1892.202308050 復制
骨質疏松以骨量降低、骨微結構破壞為特征，可增加骨質脆弱和骨折易感性的風險。預計到2050年，我國骨質疏松癥和低骨量人群將達到4億，對個人及社會造成嚴重健康負擔[1]。膽汁酸是一類存在于肝腸循環中，并對脂類消化吸收、免疫功能、代謝狀態發揮調控作用的脂類代謝物[2]。既往研究發現[3]，絕經后婦女血清膽汁酸水平與腰椎、股骨頸和全髖骨密度成正相關，與骨吸收的生物標志物β-骨膠原交聯（β-isomerized C-terminal telopeptides，β-CTX）濃度成負相關。在慢性膽汁淤積患者中，骨質疏松患病率也高達30%～40%[4]。由此可知，膽汁酸代謝與骨代謝之間存在一定潛在關聯，而調控膽汁酸代謝對于骨穩態的重塑是否具有意義也值得進一步探討。
石膽酸（lithocholic acid，LCA）是由鵝去氧膽酸和熊脫氧膽酸經腸道細菌作用后產生的次級膽汁酸。作為生理洗滌劑，LCA可以調控脂質吸收，但對肝細胞卻表現出毒性作用。而作為核受體法尼醇X受體（farnesoid X receptor，FXR）、孕烷受體、維生素D受體（vitamin D receptor，VDR）及膜受體G蛋白偶聯膽汁酸受體1（takeda G protein-coupled receptor 5，TGR5）的配體，LCA參與膽汁酸代謝反饋、能量代謝調節以及炎癥反應的發生[5-7]。既往研究[8]認為LCA可通過抑制DNA修復酶和促進細胞增殖來促進腫瘤發展；但新近研究發現，LCA可能還具有抑制肝臟腸道炎癥、抗衰老和抗腫瘤作用[9]。而在廢用性及絕經后骨質疏松模型中，次級膽汁酸LCA水平的變化也被證明與骨量丟失密切相關[9-10]。
BMSCs是一類具有多向分化潛能的干細胞，可成骨、成肌、成軟骨、成脂譜系等多向分化。BMSCs向成骨細胞或脂肪細胞的譜系特異性分化受許多旁分泌因子的調節，包括細胞因子、生長因子和激素，這些因子和激素誘導細胞間信號傳導，隨后激活關鍵轉錄因子，從而調節譜系分化方向。Runt相關轉錄因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）以及Osterix是成骨分化的重要轉錄因子，兩者通過作用于成骨細胞前體觸發BMSCs成骨分化，并階段性表達ALP、整合素結合唾液酸蛋白、Ⅰ型膠原、骨橋蛋白、骨γ-羧基谷氨酸蛋白、牙基質蛋白1和硬化素[11]。骨髓脂肪細胞約占全身脂肪量的10%，以調節型及結構型存在于骨髓腔。在轉錄因子Zfp521、Zfp423、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）和CCAAT增強子結合蛋白（CCAAT/enhancer-binding proteins，C/EBP）α/β的刺激下，脂肪祖細胞分化為骨髓脂肪細胞并表達較低水平的脂肪特異性標志物，包括脂肪酸結合蛋白4、瘦素和脂聯素[12]。在絕經后骨質疏松研究中，雌激素撤退所誘發的炎癥和氧化應激環境促進成骨細胞群與成脂細胞群之間的正常平衡向成脂分化傾斜，從而威脅骨骼的健康和完整性[12]。雖然目前研究有限，但已有研究證實運動、飲食調整以及雌激素補充等干預措施可通過減弱BMSCs成脂分化作用，從而產生骨骼獲益[13]。因此，尋找調控BMSCs成骨分化與成脂分化的關鍵因子以干預成骨-成脂分化平衡，對于重建骨質結構和維持骨骼功能具有重要意義。目前尚無研究探討LCA對BMSCs成骨-成脂分化平衡的影響。鑒于此，本研究擬探討LCA對BMSCs成骨-成脂分化平衡是否存在調控作用，以期為闡明骨質疏松癥的發生機制和尋找新的治療靶點提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、儀器
10周齡SPF級C57BL/6J雌性小鼠16只，體質量約22 g，購自南京大學模型動物中心，飼養于四川大學華西科技園動物實驗中心。飼養條件：溫度（25±2）°C、濕度50%±5%，自由飲水和標準飲食，12 h光照/黑暗周期。經適應性飼養1周后用于實驗。
LCA（上海麥克林生化科技股份有限公司）；FBS、青霉素/鏈霉素、α-MEM培養基（GIBCO公司，美國）；RNA提取試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser、TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（Takara公司，日本）；油紅O染液（北京索萊寶科技有限公司）；Ⅰ型前膠原氨基端原肽（procollagen Ⅰ N-terminal propeptide，PINP）及β-CTX檢測試劑盒（武漢云克隆科技股份有限公司）；β甘油磷酸鈉、抗壞血酸、胰島素、地塞米松、羅格列酮、ALP染色試劑盒（Sigma公司，美國）。
Thermal Cycler PCR儀、LightCycler 96實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）儀（Bio-Rad公司，美國）；正置熒光顯微鏡（Zeiss公司，美國）；vivaCT80高分辨率微CT（SCANCO Medical公司，瑞士）。
1.2 絕經后骨質疏松動物模型相關觀測
1.2.1 模型構建及實驗分組
將12只SPF級C57BL/6J雌性小鼠隨機分為實驗組和對照組，每組6只。實驗組小鼠通過背部切口移除卵巢行雙側卵巢切除術，對照組僅移除卵巢周圍相同體積脂肪組織。術后小鼠均于相同條件下飼養，每周檢測體質量。術后4周注射過量2%戊巴比妥鈉處死小鼠，收集小鼠股骨、脛骨、肝臟和血清進行相關分析，觀察子宮萎縮情況。
1.2.2 骨量分析
將兩組小鼠右側股骨標本固定于4%多聚甲醛，通過micro-CT進行微結構掃描分析和三維重建。對于松質骨，將生長板下100層松質骨作為感興趣區域；對于皮質骨，將股骨干中部的100層皮質骨作為感興趣區域。主要分析參數：骨體積/組織體積（bone volume/tissue volume，BV/TV）、結構模型指數（structure model index，SMI）、骨小梁數目（trabecular number，Tb.N）、骨小梁間隔（trabecular separation，Tb.Sp）、骨皮質厚度（cortical thickness，Ct.Th）和骨表面/骨體積（bone surface/bone volume，BS/BV）。
1.2.3 骨髓脂肪定量檢測
將兩組小鼠左側脛骨標本固定于4%多聚甲醛，經脫鈣、清洗、脫水、透明化和包埋，5 μm厚切片，行HE染色觀察。采用Image J軟件選定骨髓腔區域中骨髓脂肪空泡，并行計數及面積百分比分析。
1.2.4 骨代謝改變觀測
取兩組小鼠血清樣本，采用ELISA法檢測骨轉換標志物P1NP及β-CTX表達。將標準品及小鼠血清樣本50 μL加入50 μL檢測液A，37°C孵育1 h后PBS洗板3次，每孔加100 μL檢測溶液，相同條件孵育30 min，再次PBS洗板5次。每孔加入90 μL底物溶液，相同條件孵育15 min后加入50 μL終止液，立即于450 nm波長處測定吸光度（A）值，繪制標準曲線并根據logistic曲線擬合計算相應指標濃度。
1.2.5 膽汁酸代謝改變觀測
取兩組小鼠肝臟樣本行RT-qPCR檢測。Trizol 法提取肝臟RNA，逆轉錄獲取cDNA后檢測膽汁酸代謝關鍵酶相關基因cyp7a1、cyp7b1、cyp8b1及cyp27a1表達，收集PCR所得樣本Ct 值，以β-actin為內參，采用 2–ΔΔCt 方法計算目的基因相對表達量。引物序列見表1。
表1
RT-qPCR各基因引物序列（5′→3′）
Table1.
Primer sequences of RT-qPCR (5′→3′)
1.3 LCA干預小鼠BMSCs成骨-成脂分化觀測
1.3.1 BMSCs分離培養
分離2只10周齡C57BL/6J雌性小鼠股骨和脛骨，采用離心法提取BMSCs并加入完全培養基（含10%FBS和1%青霉素/鏈霉素的α-MEM培養基）培養，連續傳代至第3代用于后續實驗。
1.3.2 細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）法檢測細胞毒性
將第3代BMSCs細胞懸液以2×104個/孔密度接種于96孔板，培養4 h待細胞貼壁后，分別加入含0、1、10、100 μmol/L LCA的完全培養基孵育24 h后，更換培養基為含10%CCK-8的完全培養基，分別于孵育1、2、3、4 h時用酶標儀測定450 nm波長處A值。
1.3.3 成骨誘導培養ALP染色觀察
將第3代BMSCs接種于6孔板，分別加入含0、1、10、100 μmol/L LCA的完全培養基干預，待細胞達80%以上融合后行成骨誘導分化培養，成骨培養基為含50 μg/mL維生素C、10 mmol/L β甘油磷酸鹽的α-MEM完全培養基，隔2天換液1次。誘導分化7 d，按照ALP染色試劑盒說明書操作行ALP染色觀察。
1.3.4 成脂誘導培養油紅O染色觀察
將第3代BMSCs接種于6孔板，分別加入含0、1、10、100 μmol/L LCA的完全培養基干預，待細胞達80%以上融合后行成脂誘導分化培養。根據分化階段不同，成脂培養基在加入了含10%FBS和1%青霉素/鏈霉素的H-DMEM培養基基礎上，配方有所差異：第1天10 mg/mL胰島素、1 μmol/L地塞米松、62.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、1 mmol/L羅格列酮；第4天10 mg/mL胰島素、1 mmol/L羅格列酮；第7天10 mg/mL胰島素。誘導分化7 d行油紅O染色觀察。
1.3.5 RT-qPCR檢測成骨、成脂相關基因表達
取各濃度LCA干預組成骨或成脂誘導分化7 d的細胞，采用RNA提取試劑盒過柱法提取細胞RNA，逆轉錄獲取cDNA后檢測成骨細胞相關基因ALP、Runx2、骨鈣素（osteocalcin，OCN）以及成脂細胞相關基因脂聯素（adiponectin，Adipoq）、脂肪酸結合蛋白（fatty acid binding protein 4，FABP4）、PPARγ表達，采用 2–ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。引物序列見表1。
1.4 統計學方法
采用Graphpad-prism統計軟件進行分析。計量資料經Shapiro-Wilk正態性檢驗，均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；兩組多個時間點比較采用重復測量方差分析，若不滿足球形檢驗，采用Greenhouse-Geisser法進行校正，同一組別不同時間點比較采用Bonferroni法，同一時間點不同組別間比較采用多因素方差分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 絕經后骨質疏松動物模型相關觀測
2.1.1 體質量和子宮萎縮情況分析
術后各時間點兩組小鼠體質量均較術前顯著上升，且實驗組小鼠體質量顯著高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）；術后4周實驗組小鼠子宮質量為（0.06±0.01）g，較對照組（0.15±0.01）g明顯萎縮，差異有統計學意義（t=17.800，P<0.001）。見圖1。
圖1
兩組小鼠體質量和子宮萎縮情況
a. 各時間點體質量比較；b. 術后4周對照組（左）和實驗組（右）子宮外觀
Figure1. Body mass and uterine atrophy of mice in two groupsa. Comparison of body mass at different time points; b. Postoperative uterine appearance of control group (left) and experimental group (right) at 4 weeks
2.1.2 骨量分析
micro-CT三維重建示，與對照組比較，術后實驗組小鼠骨小梁數量減少且連接稀疏。見圖2。其中實驗組BV/TV、Tb.N較對照組顯著減少，Tb.Sp、SMI顯著增加，差異有統計學意義（P<0.05）；兩組Ct.Th和BS/BV比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。
圖2
術后4周對照組（左）和實驗組（右）小鼠micro-CT三維重建
a. 松質骨；b. 皮質骨
Figure2. Micro-CT three-dimensional reconstruction of control group (left) and experimental group (right) at 4 weeks after operationa. Trabecular bone; b. Cortical bone
表2
術后4周兩組小鼠micro-CT三維重建各指標比較（n=6，
）
Table2.
Comparison of micro-CT three-dimensional reconstruction indexes between the two groups at 4 weeks after operation (n=6, 
)
2.1.3 骨髓脂肪定量檢測
HE染色示，與對照組相比，實驗組脛骨近端的骨髓脂肪細胞數量顯著增加，幾乎填滿了整個骨髓空間（圖3）。定量分析示實驗組脂肪細胞數量為（170.17±36.24）個/視野、面積百分比為13.75%±3.98%，顯著高于對照組 ［分別為（16.17±16.06）個/視野和0.56%±0.65%］，差異有統計學意義（t=9.517，P<0.001；t=8.018，P<0.001）。
圖3
術后4周對照組（左）和實驗組（右）小鼠脛骨標本HE染色觀察
a. ×10；b. ×20
Figure3. HE staining observation of tibia specimens of mice in control group (left) and experimental group (right) at 4 weeks after operationa. ×10; b. ×20
2.1.4 骨代謝及膽汁酸代謝改變觀測
血清ELISA檢測示實驗組小鼠P1NP及β-CTX水平顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。RT-qPCR檢測示，肝臟膽汁酸代謝關鍵酶基因cyp7a1、cyp8b1及cyp27a1 mRNA相對表達量顯著低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），兩組cyp7b1 mRNA相對表達量差異無統計學意義（P>0.05）。見表3。
表3
術后4周兩組小鼠骨代謝及膽汁酸代謝各指標比較（n=6，
）
Table3.
Comparison of indexes of bone metabolism and bile acid metabolism between the two groups at 4 weeks after operation (n=6, 
)
2.2 LCA干預小鼠BMSCs成骨-成脂分化觀測
2.2.1 CCK-8法檢測細胞毒性
培養4 h內各濃度（0、1、10、100 μmol/L）LCA干預組A值比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖4。
圖4
CCK-8法檢測各濃度LCA干預組細胞毒性
Figure4.
CCK-8 method for detecting cytotoxicity of LCA intervention groups at different concentrations
2.2.2 LCA干預對BMSCs成骨誘導分化的作用
成骨誘導7 d ALP染色示，與LCA 0 μmol/L干預組比較，1 μmol/L干預組ALP陽性區域無顯著變化，10 μmol/L干預組陽性區域稍有減少，而100 μmol/L干預組陽性區域顯著減少。RT-qPCR檢測示，與LCA 0 μmol/L干預組比較，10 μmol/L和100 μmol/L干預組成骨相關基因ALP、OCN mRNA相對表達量明顯下調，100 μmol/L干預組Runx2 mRNA相對表達量明顯下調，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖5。
圖5
LCA干預對BMSCs成骨誘導分化的作用
a. 成骨誘導7 d ALP染色觀察（×10） 從左至右依次為LCA 0、1、10、100 μmol/L 干預組；b. RT-qPCR檢測各濃度LCA干預組成骨相關基因表達
Figure5. Effect of LCA intervention on osteogenic differentiation of BMSCsa. ALP staining observation on the 7th day of osteogenic induction (×10) From left to right for 0, 1, 10, and 100 μmol/L LCA intervention groups, respectively; b. The expressions of osteogenic-related genes detected by RT-qPCR
2.2.3 LCA干預對BMSCs成骨誘導分化的作用
成脂誘導7 d油紅O染色示，與LCA 0 μmol/L干預組比較，1 μmol/L干預組油紅O染色陽性區域無顯著變化，10 μmol/L及100 μmol/L干預組陽性區域增加。RT-qPCR檢測示10 μmol/L及100 μmol/L干預組成脂相關基因Adipoq、FABP4、PPARγ mRNA相對表達量顯著高于0 μmol/L干預組，1 μmol/L干預組FABP4 mRNA相對表達量高于0 μmol/L干預組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖6。
圖6
LCA干預對BMSCs成脂誘導分化的作用
a. 成脂誘導7 d油紅O染色觀察（×10） 從左至右依次為LCA 0、1、10、100 μmol/L 干預組；b. RT-qPCR檢測各濃度LCA干預組成脂相關基因表達
Figure6. Effect of LCA intervention on adipogenic differentiation of BMSCsa. Oil red O staining observation on the 7th day of adipogenic induction (×10) From left to right for 0, 1, 10, and 100 μmol/L LCA intervention groups, respectively; b. The expression of adipogenic-related genes detected by RT-qPCR
3 討論
絕經后骨質疏松是在雌激素撤退后，骨骼的骨形成與骨吸收之間動態平衡遭到破壞，且骨吸收占主導地位，從而引起骨質流失的代謝性疾病。骨髓中含有可分化為成骨細胞及脂肪細胞的BMSCs，以及能分化為破骨細胞的單核細胞/巨噬細胞系，這3種細胞的分化平衡共同參與維持骨穩態[14]。本研究中，雌激素撤退后引起的骨量變化表現為松質骨小梁明顯破壞，而皮質骨并未受影響。這種骨量和骨微結構的破壞主要是由破骨能力增強以及其繼發的成骨能力增強所造成的高骨轉換狀態引發，具體體現在骨形成標志物P1NP及骨吸收標志物β-CTX表達的共同上升。近年來，BMSCs在多種病理狀態下傾向性分化為骨髓脂肪組織后，在骨微環境及骨重塑中的作用備受關注。本研究結果顯示，絕經后骨質疏松小鼠的BMSCs傾向分化為脂肪細胞能力增強，骨髓腔內骨髓脂肪數量明顯增加，面積顯著擴張。既往研究已證實，骨髓脂肪組織通過分泌許多內分泌因子（即脂肪因子和促炎細胞因子）來抑制成骨細胞，促進破骨細胞功能，從而影響骨穩態[15]。因此，靶向干預BMSCs成骨-成脂分化從而干預骨重塑過程成為研究熱點。
關于骨代謝與膽汁酸代謝之間的關聯性，已在膽汁淤積性疾病以及骨質疏松疾病模型中得到驗證。原發性膽汁性肝硬化患者骨質疏松患病率高達32.5%，而肝功能障礙分級、膽汁淤積嚴重程度及持續時間被認為是影響骨質流失程度的主要危險因素[16]。盡管具體機制不明，但該病理狀態下骨形成降低和骨吸收增強均有報道，其發生機制與維生素D和鈣缺乏、骨保護素與OCN不足、IGF-1減少、用藥方案選擇、遺傳易感性，以及膽紅素破壞成骨細胞活力和成骨分化、礦化能力相關[17]。
在本研究中，絕經后動物模型膽汁酸經典途徑代謝關鍵酶cyp7a1以及替代途徑代謝酶cyp27a1表達明顯下調，表明絕經后雌激素撤退的病理模型下，膽汁酸合成代謝整體處于抑制狀態。目前，多項基于骨質疏松患者的臨床及動物模型實驗印證了膽汁酸代謝的改變，因此靶向膽汁酸代謝對于骨代謝的影響成為研究熱點[9，16]。刺五加苷與仙靈骨葆膠囊對骨量提升具有積極作用，而這種正向調節被證明是通過調控膽汁酸代謝實現的[17-18]。膽汁酸可以與成骨細胞表達的FXR、TGR5和VDR結合，從而調節成骨。米諾環素治療后紊亂的腸道菌群改變了循環膽汁酸譜，進而通過破壞腸道/肝臟膽汁酸軸以衰減FXR依賴性信號的方式抑制成骨細胞分化[19]。FXR敲除鼠的成骨潛力遭到損害，破骨能力提升，并且可能伴隨成脂分化能力增強；而鵝去氧膽酸作為FXR激動劑可上調成骨相關轉錄因子Runx2，并增強細胞外信號調節激酶以及β-連環蛋白信號傳導以促進成骨分化，并同時抑制成脂分化和破骨分化發生[19-20]。敲除TGR5對于青年及成年小鼠的骨量無明顯影響，而在老年及去卵巢小鼠中則呈現出明顯骨量丟失，可能歸因于Amp活化蛋白激酶信號通路表達增強而引起的破骨生成增加[21]。TGR5的激活還能促進Runx2的表達，增強ALP活性、細胞外基質礦化和成骨細胞基因（如ALP、OCN和Osterix）的表達，而FXR及TGR5的單向及雙向激動劑均具有抑制破骨分化的效益[22-23]。牛磺熊去氧膽酸是一種美國食品藥品監督管理局（FDA）批準的用于治療慢性膽汁淤積性肝病的親水膽汁酸，已被證明可以治療去卵巢小鼠的骨量丟失。牛磺熊去氧膽酸給藥后，股骨遠端骨小梁結構保留增多，總骨體積、骨密度、骨體積百分比等指標較對照組有顯著改善，因此牛磺熊去氧膽酸除治療膽汁淤積外，可能對其并發的骨質流失具有重要意義[24]。由此可見，靶向膽汁酸代謝及其受體對于調控骨代謝具有重要意義。
異常的BMSCs譜系分化是絕經后骨質疏松發病機制之一，增加的骨髓脂肪組織積累以犧牲骨形成為代價，并損害成骨再生和造血功能[25]。鑒于既往研究報道絕經后骨質疏松模型中LCA水平呈顯著變化[10]，本研究選用LCA進一步探討其對BMSCs譜系分化是否具有干擾作用，結果顯示LCA干預后成骨分化轉錄因子Runx2以及成骨特異性基質蛋白ALP、OCN的基因表達明顯下調，提示LCA對于BMSCs的成骨分化有損害作用。這與既往有關LCA對于成骨細胞系（小鼠骨樣細胞MLO-Y4和MLO-A5，人成骨肉瘤細胞Saos-2）的成骨分化負性作用結果一致。而這種作用可能主要是通過破壞抗凋亡基因B淋巴細胞瘤2基因（B-cell lymphoma 2，BCL-2）和促凋亡基因BCL-2相關X蛋白的表達平衡來直接損害成骨細胞系的成骨潛力，但具體機制不明[24-25]。在LCA干預Saos-2細胞系的實驗中，成骨生成相關基因ALP和BMP的表達顯著降低，伴隨著破骨分化相關NF-κB配體受體激活劑和降鈣素受體表達上調，代表著LCA對于成骨生成以及破骨生成的雙重調節作用[26]。此外，上述研究發現熊去氧膽酸在一定程度上可以中和LCA對成骨細胞的毒性作用，表明熊去氧膽酸作為膽汁淤積性疾病的一線治療藥物可能對并發的骨質疏松產生額外骨骼獲益[24-25]。作為VDR低親和力配體，LCA還可以競爭性激活VDR，從而降低維生素D對于成骨細胞的OCN及NF-κB配體的表達刺激作用[27]。在維生素D缺乏情況下，LCA通過調節腸道吸收和骨骼動員來增加血清鈣，但血清鈣、磷的增加也可能進一步加重慢性腎臟病的血管鈣化[26-27]。本研究首次表明LCA對BMSCs成脂分化具有促進作用，經過LCA干預后，成脂相關轉錄因子PPARγ以及脂肪相關內源性細胞因子FABP4和Adipoq表達顯著增加，表明BMSCs傾向性分化為骨髓脂肪細胞的能力增強。雖然具體機制不明，但我們分析激活FXR-PPARγ信號通路促進脂肪細胞分化可能是其作用機制之一[28]。此外，作為TGR5的重要激動劑，既往研究發現LCA抑制破骨分化的功能可能通過TGR5及其下游腺苷酸活化蛋白激酶信號通路實現[21]。因此，LCA對于骨代謝的調節作用是多方面的，包括調控成骨分化、成脂分化、破骨分化及機體鈣磷平衡，但具體機制尚不明確。
綜上述，本研究結果提示LCA具有干擾BMSCs成骨-成脂分化的作用，從而對骨穩態產生潛在有害影響；未來靶向LCA代謝及其受體的深入研究將為骨質疏松的預防及治療提供新思路。然而，本研究尚有一定局限性，亟待通過靶向膽汁酸代謝組的高通量測序和在體小鼠的LCA干預為實驗假說提供有力證據，以及深入探討LCA對于成骨-成脂分化平衡的具體作用機制也具有重要意義。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；基金項目經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經四川大學華西醫院倫理委員會批準（202303023001）；實驗動物使用許可證號：SYXK（川）2021-0248
作者貢獻聲明 王翠：文章撰寫、研究實施；李姣：研究實施；劉璐：數據分析及繪圖；魯凌云：研究設計；余希杰：審校文章，基金支持
骨質疏松以骨量降低、骨微結構破壞為特征，可增加骨質脆弱和骨折易感性的風險。預計到2050年，我國骨質疏松癥和低骨量人群將達到4億，對個人及社會造成嚴重健康負擔[1]。膽汁酸是一類存在于肝腸循環中，并對脂類消化吸收、免疫功能、代謝狀態發揮調控作用的脂類代謝物[2]。既往研究發現[3]，絕經后婦女血清膽汁酸水平與腰椎、股骨頸和全髖骨密度成正相關，與骨吸收的生物標志物β-骨膠原交聯（β-isomerized C-terminal telopeptides，β-CTX）濃度成負相關。在慢性膽汁淤積患者中，骨質疏松患病率也高達30%～40%[4]。由此可知，膽汁酸代謝與骨代謝之間存在一定潛在關聯，而調控膽汁酸代謝對于骨穩態的重塑是否具有意義也值得進一步探討。
石膽酸（lithocholic acid，LCA）是由鵝去氧膽酸和熊脫氧膽酸經腸道細菌作用后產生的次級膽汁酸。作為生理洗滌劑，LCA可以調控脂質吸收，但對肝細胞卻表現出毒性作用。而作為核受體法尼醇X受體（farnesoid X receptor，FXR）、孕烷受體、維生素D受體（vitamin D receptor，VDR）及膜受體G蛋白偶聯膽汁酸受體1（takeda G protein-coupled receptor 5，TGR5）的配體，LCA參與膽汁酸代謝反饋、能量代謝調節以及炎癥反應的發生[5-7]。既往研究[8]認為LCA可通過抑制DNA修復酶和促進細胞增殖來促進腫瘤發展；但新近研究發現，LCA可能還具有抑制肝臟腸道炎癥、抗衰老和抗腫瘤作用[9]。而在廢用性及絕經后骨質疏松模型中，次級膽汁酸LCA水平的變化也被證明與骨量丟失密切相關[9-10]。
BMSCs是一類具有多向分化潛能的干細胞，可成骨、成肌、成軟骨、成脂譜系等多向分化。BMSCs向成骨細胞或脂肪細胞的譜系特異性分化受許多旁分泌因子的調節，包括細胞因子、生長因子和激素，這些因子和激素誘導細胞間信號傳導，隨后激活關鍵轉錄因子，從而調節譜系分化方向。Runt相關轉錄因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）以及Osterix是成骨分化的重要轉錄因子，兩者通過作用于成骨細胞前體觸發BMSCs成骨分化，并階段性表達ALP、整合素結合唾液酸蛋白、Ⅰ型膠原、骨橋蛋白、骨γ-羧基谷氨酸蛋白、牙基質蛋白1和硬化素[11]。骨髓脂肪細胞約占全身脂肪量的10%，以調節型及結構型存在于骨髓腔。在轉錄因子Zfp521、Zfp423、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）和CCAAT增強子結合蛋白（CCAAT/enhancer-binding proteins，C/EBP）α/β的刺激下，脂肪祖細胞分化為骨髓脂肪細胞并表達較低水平的脂肪特異性標志物，包括脂肪酸結合蛋白4、瘦素和脂聯素[12]。在絕經后骨質疏松研究中，雌激素撤退所誘發的炎癥和氧化應激環境促進成骨細胞群與成脂細胞群之間的正常平衡向成脂分化傾斜，從而威脅骨骼的健康和完整性[12]。雖然目前研究有限，但已有研究證實運動、飲食調整以及雌激素補充等干預措施可通過減弱BMSCs成脂分化作用，從而產生骨骼獲益[13]。因此，尋找調控BMSCs成骨分化與成脂分化的關鍵因子以干預成骨-成脂分化平衡，對于重建骨質結構和維持骨骼功能具有重要意義。目前尚無研究探討LCA對BMSCs成骨-成脂分化平衡的影響。鑒于此，本研究擬探討LCA對BMSCs成骨-成脂分化平衡是否存在調控作用，以期為闡明骨質疏松癥的發生機制和尋找新的治療靶點提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、儀器
10周齡SPF級C57BL/6J雌性小鼠16只，體質量約22 g，購自南京大學模型動物中心，飼養于四川大學華西科技園動物實驗中心。飼養條件：溫度（25±2）°C、濕度50%±5%，自由飲水和標準飲食，12 h光照/黑暗周期。經適應性飼養1周后用于實驗。
LCA（上海麥克林生化科技股份有限公司）；FBS、青霉素/鏈霉素、α-MEM培養基（GIBCO公司，美國）；RNA提取試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser、TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（Takara公司，日本）；油紅O染液（北京索萊寶科技有限公司）；Ⅰ型前膠原氨基端原肽（procollagen Ⅰ N-terminal propeptide，PINP）及β-CTX檢測試劑盒（武漢云克隆科技股份有限公司）；β甘油磷酸鈉、抗壞血酸、胰島素、地塞米松、羅格列酮、ALP染色試劑盒（Sigma公司，美國）。
Thermal Cycler PCR儀、LightCycler 96實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）儀（Bio-Rad公司，美國）；正置熒光顯微鏡（Zeiss公司，美國）；vivaCT80高分辨率微CT（SCANCO Medical公司，瑞士）。
1.2 絕經后骨質疏松動物模型相關觀測
1.2.1 模型構建及實驗分組
將12只SPF級C57BL/6J雌性小鼠隨機分為實驗組和對照組，每組6只。實驗組小鼠通過背部切口移除卵巢行雙側卵巢切除術，對照組僅移除卵巢周圍相同體積脂肪組織。術后小鼠均于相同條件下飼養，每周檢測體質量。術后4周注射過量2%戊巴比妥鈉處死小鼠，收集小鼠股骨、脛骨、肝臟和血清進行相關分析，觀察子宮萎縮情況。
1.2.2 骨量分析
將兩組小鼠右側股骨標本固定于4%多聚甲醛，通過micro-CT進行微結構掃描分析和三維重建。對于松質骨，將生長板下100層松質骨作為感興趣區域；對于皮質骨，將股骨干中部的100層皮質骨作為感興趣區域。主要分析參數：骨體積/組織體積（bone volume/tissue volume，BV/TV）、結構模型指數（structure model index，SMI）、骨小梁數目（trabecular number，Tb.N）、骨小梁間隔（trabecular separation，Tb.Sp）、骨皮質厚度（cortical thickness，Ct.Th）和骨表面/骨體積（bone surface/bone volume，BS/BV）。
1.2.3 骨髓脂肪定量檢測
將兩組小鼠左側脛骨標本固定于4%多聚甲醛，經脫鈣、清洗、脫水、透明化和包埋，5 μm厚切片，行HE染色觀察。采用Image J軟件選定骨髓腔區域中骨髓脂肪空泡，并行計數及面積百分比分析。
1.2.4 骨代謝改變觀測
取兩組小鼠血清樣本，采用ELISA法檢測骨轉換標志物P1NP及β-CTX表達。將標準品及小鼠血清樣本50 μL加入50 μL檢測液A，37°C孵育1 h后PBS洗板3次，每孔加100 μL檢測溶液，相同條件孵育30 min，再次PBS洗板5次。每孔加入90 μL底物溶液，相同條件孵育15 min后加入50 μL終止液，立即于450 nm波長處測定吸光度（A）值，繪制標準曲線并根據logistic曲線擬合計算相應指標濃度。
1.2.5 膽汁酸代謝改變觀測
取兩組小鼠肝臟樣本行RT-qPCR檢測。Trizol 法提取肝臟RNA，逆轉錄獲取cDNA后檢測膽汁酸代謝關鍵酶相關基因cyp7a1、cyp7b1、cyp8b1及cyp27a1表達，收集PCR所得樣本Ct 值，以β-actin為內參，采用 2–ΔΔCt 方法計算目的基因相對表達量。引物序列見表1。
表1
RT-qPCR各基因引物序列（5′→3′）
Table1.
Primer sequences of RT-qPCR (5′→3′)
1.3 LCA干預小鼠BMSCs成骨-成脂分化觀測
1.3.1 BMSCs分離培養
分離2只10周齡C57BL/6J雌性小鼠股骨和脛骨，采用離心法提取BMSCs并加入完全培養基（含10%FBS和1%青霉素/鏈霉素的α-MEM培養基）培養，連續傳代至第3代用于后續實驗。
1.3.2 細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）法檢測細胞毒性
將第3代BMSCs細胞懸液以2×104個/孔密度接種于96孔板，培養4 h待細胞貼壁后，分別加入含0、1、10、100 μmol/L LCA的完全培養基孵育24 h后，更換培養基為含10%CCK-8的完全培養基，分別于孵育1、2、3、4 h時用酶標儀測定450 nm波長處A值。
1.3.3 成骨誘導培養ALP染色觀察
將第3代BMSCs接種于6孔板，分別加入含0、1、10、100 μmol/L LCA的完全培養基干預，待細胞達80%以上融合后行成骨誘導分化培養，成骨培養基為含50 μg/mL維生素C、10 mmol/L β甘油磷酸鹽的α-MEM完全培養基，隔2天換液1次。誘導分化7 d，按照ALP染色試劑盒說明書操作行ALP染色觀察。
1.3.4 成脂誘導培養油紅O染色觀察
將第3代BMSCs接種于6孔板，分別加入含0、1、10、100 μmol/L LCA的完全培養基干預，待細胞達80%以上融合后行成脂誘導分化培養。根據分化階段不同，成脂培養基在加入了含10%FBS和1%青霉素/鏈霉素的H-DMEM培養基基礎上，配方有所差異：第1天10 mg/mL胰島素、1 μmol/L地塞米松、62.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、1 mmol/L羅格列酮；第4天10 mg/mL胰島素、1 mmol/L羅格列酮；第7天10 mg/mL胰島素。誘導分化7 d行油紅O染色觀察。
1.3.5 RT-qPCR檢測成骨、成脂相關基因表達
取各濃度LCA干預組成骨或成脂誘導分化7 d的細胞，采用RNA提取試劑盒過柱法提取細胞RNA，逆轉錄獲取cDNA后檢測成骨細胞相關基因ALP、Runx2、骨鈣素（osteocalcin，OCN）以及成脂細胞相關基因脂聯素（adiponectin，Adipoq）、脂肪酸結合蛋白（fatty acid binding protein 4，FABP4）、PPARγ表達，采用 2–ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。引物序列見表1。
1.4 統計學方法
采用Graphpad-prism統計軟件進行分析。計量資料經Shapiro-Wilk正態性檢驗，均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；兩組多個時間點比較采用重復測量方差分析，若不滿足球形檢驗，采用Greenhouse-Geisser法進行校正，同一組別不同時間點比較采用Bonferroni法，同一時間點不同組別間比較采用多因素方差分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 絕經后骨質疏松動物模型相關觀測
2.1.1 體質量和子宮萎縮情況分析
術后各時間點兩組小鼠體質量均較術前顯著上升，且實驗組小鼠體質量顯著高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）；術后4周實驗組小鼠子宮質量為（0.06±0.01）g，較對照組（0.15±0.01）g明顯萎縮，差異有統計學意義（t=17.800，P<0.001）。見圖1。
圖1
兩組小鼠體質量和子宮萎縮情況
a. 各時間點體質量比較；b. 術后4周對照組（左）和實驗組（右）子宮外觀
Figure1. Body mass and uterine atrophy of mice in two groupsa. Comparison of body mass at different time points; b. Postoperative uterine appearance of control group (left) and experimental group (right) at 4 weeks
2.1.2 骨量分析
micro-CT三維重建示，與對照組比較，術后實驗組小鼠骨小梁數量減少且連接稀疏。見圖2。其中實驗組BV/TV、Tb.N較對照組顯著減少，Tb.Sp、SMI顯著增加，差異有統計學意義（P<0.05）；兩組Ct.Th和BS/BV比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。
圖2
術后4周對照組（左）和實驗組（右）小鼠micro-CT三維重建
a. 松質骨；b. 皮質骨
Figure2. Micro-CT three-dimensional reconstruction of control group (left) and experimental group (right) at 4 weeks after operationa. Trabecular bone; b. Cortical bone
表2
術后4周兩組小鼠micro-CT三維重建各指標比較（n=6，）
Table2.
Comparison of micro-CT three-dimensional reconstruction indexes between the two groups at 4 weeks after operation (n=6, )
2.1.3 骨髓脂肪定量檢測
HE染色示，與對照組相比，實驗組脛骨近端的骨髓脂肪細胞數量顯著增加，幾乎填滿了整個骨髓空間（圖3）。定量分析示實驗組脂肪細胞數量為（170.17±36.24）個/視野、面積百分比為13.75%±3.98%，顯著高于對照組 ［分別為（16.17±16.06）個/視野和0.56%±0.65%］，差異有統計學意義（t=9.517，P<0.001；t=8.018，P<0.001）。
圖3
術后4周對照組（左）和實驗組（右）小鼠脛骨標本HE染色觀察
a. ×10；b. ×20
Figure3. HE staining observation of tibia specimens of mice in control group (left) and experimental group (right) at 4 weeks after operationa. ×10; b. ×20
2.1.4 骨代謝及膽汁酸代謝改變觀測
血清ELISA檢測示實驗組小鼠P1NP及β-CTX水平顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。RT-qPCR檢測示，肝臟膽汁酸代謝關鍵酶基因cyp7a1、cyp8b1及cyp27a1 mRNA相對表達量顯著低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），兩組cyp7b1 mRNA相對表達量差異無統計學意義（P>0.05）。見表3。
表3
術后4周兩組小鼠骨代謝及膽汁酸代謝各指標比較（n=6，）
Table3.
Comparison of indexes of bone metabolism and bile acid metabolism between the two groups at 4 weeks after operation (n=6, )
2.2 LCA干預小鼠BMSCs成骨-成脂分化觀測
2.2.1 CCK-8法檢測細胞毒性
培養4 h內各濃度（0、1、10、100 μmol/L）LCA干預組A值比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖4。
圖4
CCK-8法檢測各濃度LCA干預組細胞毒性
Figure4.
CCK-8 method for detecting cytotoxicity of LCA intervention groups at different concentrations
2.2.2 LCA干預對BMSCs成骨誘導分化的作用
成骨誘導7 d ALP染色示，與LCA 0 μmol/L干預組比較，1 μmol/L干預組ALP陽性區域無顯著變化，10 μmol/L干預組陽性區域稍有減少，而100 μmol/L干預組陽性區域顯著減少。RT-qPCR檢測示，與LCA 0 μmol/L干預組比較，10 μmol/L和100 μmol/L干預組成骨相關基因ALP、OCN mRNA相對表達量明顯下調，100 μmol/L干預組Runx2 mRNA相對表達量明顯下調，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖5。
圖5
LCA干預對BMSCs成骨誘導分化的作用
a. 成骨誘導7 d ALP染色觀察（×10） 從左至右依次為LCA 0、1、10、100 μmol/L 干預組；b. RT-qPCR檢測各濃度LCA干預組成骨相關基因表達
Figure5. Effect of LCA intervention on osteogenic differentiation of BMSCsa. ALP staining observation on the 7th day of osteogenic induction (×10) From left to right for 0, 1, 10, and 100 μmol/L LCA intervention groups, respectively; b. The expressions of osteogenic-related genes detected by RT-qPCR
2.2.3 LCA干預對BMSCs成骨誘導分化的作用
成脂誘導7 d油紅O染色示，與LCA 0 μmol/L干預組比較，1 μmol/L干預組油紅O染色陽性區域無顯著變化，10 μmol/L及100 μmol/L干預組陽性區域增加。RT-qPCR檢測示10 μmol/L及100 μmol/L干預組成脂相關基因Adipoq、FABP4、PPARγ mRNA相對表達量顯著高于0 μmol/L干預組，1 μmol/L干預組FABP4 mRNA相對表達量高于0 μmol/L干預組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖6。
圖6
LCA干預對BMSCs成脂誘導分化的作用
a. 成脂誘導7 d油紅O染色觀察（×10） 從左至右依次為LCA 0、1、10、100 μmol/L 干預組；b. RT-qPCR檢測各濃度LCA干預組成脂相關基因表達
Figure6. Effect of LCA intervention on adipogenic differentiation of BMSCsa. Oil red O staining observation on the 7th day of adipogenic induction (×10) From left to right for 0, 1, 10, and 100 μmol/L LCA intervention groups, respectively; b. The expression of adipogenic-related genes detected by RT-qPCR
3 討論
絕經后骨質疏松是在雌激素撤退后，骨骼的骨形成與骨吸收之間動態平衡遭到破壞，且骨吸收占主導地位，從而引起骨質流失的代謝性疾病。骨髓中含有可分化為成骨細胞及脂肪細胞的BMSCs，以及能分化為破骨細胞的單核細胞/巨噬細胞系，這3種細胞的分化平衡共同參與維持骨穩態[14]。本研究中，雌激素撤退后引起的骨量變化表現為松質骨小梁明顯破壞，而皮質骨并未受影響。這種骨量和骨微結構的破壞主要是由破骨能力增強以及其繼發的成骨能力增強所造成的高骨轉換狀態引發，具體體現在骨形成標志物P1NP及骨吸收標志物β-CTX表達的共同上升。近年來，BMSCs在多種病理狀態下傾向性分化為骨髓脂肪組織后，在骨微環境及骨重塑中的作用備受關注。本研究結果顯示，絕經后骨質疏松小鼠的BMSCs傾向分化為脂肪細胞能力增強，骨髓腔內骨髓脂肪數量明顯增加，面積顯著擴張。既往研究已證實，骨髓脂肪組織通過分泌許多內分泌因子（即脂肪因子和促炎細胞因子）來抑制成骨細胞，促進破骨細胞功能，從而影響骨穩態[15]。因此，靶向干預BMSCs成骨-成脂分化從而干預骨重塑過程成為研究熱點。
關于骨代謝與膽汁酸代謝之間的關聯性，已在膽汁淤積性疾病以及骨質疏松疾病模型中得到驗證。原發性膽汁性肝硬化患者骨質疏松患病率高達32.5%，而肝功能障礙分級、膽汁淤積嚴重程度及持續時間被認為是影響骨質流失程度的主要危險因素[16]。盡管具體機制不明，但該病理狀態下骨形成降低和骨吸收增強均有報道，其發生機制與維生素D和鈣缺乏、骨保護素與OCN不足、IGF-1減少、用藥方案選擇、遺傳易感性，以及膽紅素破壞成骨細胞活力和成骨分化、礦化能力相關[17]。
在本研究中，絕經后動物模型膽汁酸經典途徑代謝關鍵酶cyp7a1以及替代途徑代謝酶cyp27a1表達明顯下調，表明絕經后雌激素撤退的病理模型下，膽汁酸合成代謝整體處于抑制狀態。目前，多項基于骨質疏松患者的臨床及動物模型實驗印證了膽汁酸代謝的改變，因此靶向膽汁酸代謝對于骨代謝的影響成為研究熱點[9，16]。刺五加苷與仙靈骨葆膠囊對骨量提升具有積極作用，而這種正向調節被證明是通過調控膽汁酸代謝實現的[17-18]。膽汁酸可以與成骨細胞表達的FXR、TGR5和VDR結合，從而調節成骨。米諾環素治療后紊亂的腸道菌群改變了循環膽汁酸譜，進而通過破壞腸道/肝臟膽汁酸軸以衰減FXR依賴性信號的方式抑制成骨細胞分化[19]。FXR敲除鼠的成骨潛力遭到損害，破骨能力提升，并且可能伴隨成脂分化能力增強；而鵝去氧膽酸作為FXR激動劑可上調成骨相關轉錄因子Runx2，并增強細胞外信號調節激酶以及β-連環蛋白信號傳導以促進成骨分化，并同時抑制成脂分化和破骨分化發生[19-20]。敲除TGR5對于青年及成年小鼠的骨量無明顯影響，而在老年及去卵巢小鼠中則呈現出明顯骨量丟失，可能歸因于Amp活化蛋白激酶信號通路表達增強而引起的破骨生成增加[21]。TGR5的激活還能促進Runx2的表達，增強ALP活性、細胞外基質礦化和成骨細胞基因（如ALP、OCN和Osterix）的表達，而FXR及TGR5的單向及雙向激動劑均具有抑制破骨分化的效益[22-23]。牛磺熊去氧膽酸是一種美國食品藥品監督管理局（FDA）批準的用于治療慢性膽汁淤積性肝病的親水膽汁酸，已被證明可以治療去卵巢小鼠的骨量丟失。牛磺熊去氧膽酸給藥后，股骨遠端骨小梁結構保留增多，總骨體積、骨密度、骨體積百分比等指標較對照組有顯著改善，因此牛磺熊去氧膽酸除治療膽汁淤積外，可能對其并發的骨質流失具有重要意義[24]。由此可見，靶向膽汁酸代謝及其受體對于調控骨代謝具有重要意義。
異常的BMSCs譜系分化是絕經后骨質疏松發病機制之一，增加的骨髓脂肪組織積累以犧牲骨形成為代價，并損害成骨再生和造血功能[25]。鑒于既往研究報道絕經后骨質疏松模型中LCA水平呈顯著變化[10]，本研究選用LCA進一步探討其對BMSCs譜系分化是否具有干擾作用，結果顯示LCA干預后成骨分化轉錄因子Runx2以及成骨特異性基質蛋白ALP、OCN的基因表達明顯下調，提示LCA對于BMSCs的成骨分化有損害作用。這與既往有關LCA對于成骨細胞系（小鼠骨樣細胞MLO-Y4和MLO-A5，人成骨肉瘤細胞Saos-2）的成骨分化負性作用結果一致。而這種作用可能主要是通過破壞抗凋亡基因B淋巴細胞瘤2基因（B-cell lymphoma 2，BCL-2）和促凋亡基因BCL-2相關X蛋白的表達平衡來直接損害成骨細胞系的成骨潛力，但具體機制不明[24-25]。在LCA干預Saos-2細胞系的實驗中，成骨生成相關基因ALP和BMP的表達顯著降低，伴隨著破骨分化相關NF-κB配體受體激活劑和降鈣素受體表達上調，代表著LCA對于成骨生成以及破骨生成的雙重調節作用[26]。此外，上述研究發現熊去氧膽酸在一定程度上可以中和LCA對成骨細胞的毒性作用，表明熊去氧膽酸作為膽汁淤積性疾病的一線治療藥物可能對并發的骨質疏松產生額外骨骼獲益[24-25]。作為VDR低親和力配體，LCA還可以競爭性激活VDR，從而降低維生素D對于成骨細胞的OCN及NF-κB配體的表達刺激作用[27]。在維生素D缺乏情況下，LCA通過調節腸道吸收和骨骼動員來增加血清鈣，但血清鈣、磷的增加也可能進一步加重慢性腎臟病的血管鈣化[26-27]。本研究首次表明LCA對BMSCs成脂分化具有促進作用，經過LCA干預后，成脂相關轉錄因子PPARγ以及脂肪相關內源性細胞因子FABP4和Adipoq表達顯著增加，表明BMSCs傾向性分化為骨髓脂肪細胞的能力增強。雖然具體機制不明，但我們分析激活FXR-PPARγ信號通路促進脂肪細胞分化可能是其作用機制之一[28]。此外，作為TGR5的重要激動劑，既往研究發現LCA抑制破骨分化的功能可能通過TGR5及其下游腺苷酸活化蛋白激酶信號通路實現[21]。因此，LCA對于骨代謝的調節作用是多方面的，包括調控成骨分化、成脂分化、破骨分化及機體鈣磷平衡，但具體機制尚不明確。
綜上述，本研究結果提示LCA具有干擾BMSCs成骨-成脂分化的作用，從而對骨穩態產生潛在有害影響；未來靶向LCA代謝及其受體的深入研究將為骨質疏松的預防及治療提供新思路。然而，本研究尚有一定局限性，亟待通過靶向膽汁酸代謝組的高通量測序和在體小鼠的LCA干預為實驗假說提供有力證據，以及深入探討LCA對于成骨-成脂分化平衡的具體作用機制也具有重要意義。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；基金項目經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經四川大學華西醫院倫理委員會批準（202303023001）；實驗動物使用許可證號：SYXK（川）2021-0248
作者貢獻聲明 王翠：文章撰寫、研究實施；李姣：研究實施；劉璐：數據分析及繪圖；魯凌云：研究設計；余希杰：審校文章，基金支持
