引用本文： 黃婉然, 涂君雪, 喬愛卿, 何儲君. VX765對大鼠骨關節炎和軟骨細胞炎癥的作用. 中國修復重建外科雜志, 2024, 38(1): 74-81. doi: 10.7507/1002-1892.202308053 復制
骨關節炎（osteoarthritis，OA）是最常見的變性軟骨疾病，也是60歲以上人群致殘的主要原因之一[1]。由于全球壽命延長以及飲食和生活方式的改變，OA患病率也不斷增加，已成為全球第四大致殘原因，帶來巨大經濟負擔[2]。目前，OA的發病機制和病理生理學仍不清楚，炎癥被認為是促進OA發生、發展的主要病理因素[3]。脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）是革蘭陰性細胞外壁中的結構成分之一，可提供積極的免疫激活，其誘導的軟骨細胞炎癥模型可以有效反映OA中軟骨損傷程度[4]。OA的早期治療策略主要是使用非甾體抗炎藥緩解疼痛，但伴隨著大量藥物副作用[5]。目前仍缺乏用于預防或抑制OA進展的有效藥物，迫切需要療效好、副作用小的藥物來逆轉OA進展。據報道半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase-1）在OA中激活，VX765是一種小分子Caspase-1特異性抑制劑，可在體內和體外減輕炎癥[6-7]。由于具有明顯抗炎特性，VX765在多種涉及炎癥的疾病中發揮著較大治療潛力，如急性胃潰瘍、急性心肌梗死等[8-9]。因此，VX765可能在OA中具有潛在有益作用，但目前關于VX765對OA的影響及其作用機制的研究較少。鑒于此，本研究擬探討VX765對OA大鼠和軟骨細胞的影響及其可能機制，為OA的防治提供新的治療策略。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4～6周齡雄性SPF級SD大鼠35只，體質量180～200 g，購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司。大鼠于溫度25°C、濕度40%～50%環境下飼養，自由飲食、水。
FBS、DMEM培養基（GIBCO公司，美國）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8；合肥白鯊生物科技有限公司）；VX765（上海吉至生化科技有限公司）；LPS、番紅固綠（北京索萊寶科技有限公司）；BCA蛋白質檢測試劑盒、DAPI（上海碧云天生物技術股份有限公司）；GAPDH、抗Ⅱ型膠原蛋白抗體（Abcam公司，美國）；Trizol試劑（Invitrogen公司，美國）；逆轉錄試劑盒（Takara公司，日本）；ELISA試劑盒（R&D Systems公司，美國）；牛血清白蛋白、Triton X-100（Sigma Aldrich公司，美國）；二氨基聯苯胺（武漢博士德生物工程有限公司）。
酶聯免疫檢測儀（Molecular Devices公司，美國）；化學發光成像系統（Bio-Rad Laboratories，美國）；7900HT快速實時PCR系統（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；LSM-880共聚焦熒光顯微鏡（Carl Zeiss公司，德國）；倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）。
1.2 VX765對大鼠軟骨細胞炎癥的影響及其機制
1.2.1 軟骨細胞分離與培養
取3只4周齡SD大鼠腹腔注射過量3%戊巴比妥鈉處死，按照文獻 ［10］方法從膝關節軟骨分離出軟骨細胞，用含20%FBS的DMEM培養基重懸，于37°C、5%CO2條件下培養。待細胞鋪滿培養基表面約80%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代、培養，選第3代細胞進行后續實驗。
1.2.2 CCK-8法檢測細胞活力
取第3代軟骨細胞以2×105個/mL密度接種于96孔板（0.1 mL/孔），培養過夜。加入不同濃度（0、1、5、10、20、50、100 μmol/L）VX765分別處理24、48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37°C培養4 h。使用酶聯免疫檢測儀檢測450 nm處吸光度（A）值，按以下公式計算細胞活力：（A加藥?A空白）/（A未加藥?A空白）×100%。選取無明顯細胞毒性的2個VX765濃度作為后續實驗濃度。
1.2.3 Western blot檢測
根據 CCK-8 實驗結果，將細胞分為對照組、LPS組、VX765無毒性濃度1組和VX765無毒性濃度2組。除對照組外，各組細胞均加入100 ng/mL LPS處理24 h，不同濃度VX765組加入相應濃度VX765培養24 h。從軟骨細胞中提取蛋白質，并通過BCA蛋白質檢測試劑盒對總蛋白質濃度進行定量。隨后，在SDS-PAGE上分離30 μg蛋白樣品，轉移至聚偏二氟乙烯膜上，用5%脫脂牛奶封閉后，將膜分別與一抗TGF-β1、TNF-α、IL-6、核因子E2相關的轉錄因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）、血紅素氧化酶1（heme oxygenase 1，HO-1）和GAPDH在4°C下孵育過夜，接著在室溫下與二抗孵育2 h。最后，使用化學發光成像系統成像，并通過Image J軟件進行定量分析，以與GAPDH表達量的比值作為目標蛋白相對表達量。
1.2.4 實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）檢測
實驗分組和處理方法同1.2.3，培養24 h后，使用Trizol試劑提取總RNA，逆轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA，通過7900HT快速實時PCR系統進行擴增。以GAPDH為內參，應用 2–ΔΔCt 方法計算各目的基因相對表達量。引物序列見表1。
表1
RT-qPCR各基因引物序列（5′→3′）
Table1.
Primer sequence of each gene in RT-qPCR (5′→3′)
1.2.5 ELISA檢測
實驗分組和處理方法同1.2.3，培養24 h后，使用相應的ELISA試劑盒測量軟骨細胞上清液中TGF-β1、TNF-α和IL-6的水平。
1.2.6 免疫熒光染色分析
實驗分組和處理方法同1.2.3，培養24 h后，將各組軟骨細胞用4%多聚甲醛固定15 min，然后用含1%牛血清白蛋白和0.1%Triton X-100的封閉溶液處理。將細胞與抗Nrf2抗體于4°C孵育過夜，然后加入二抗在室溫下孵育1 h。細胞核用DAPI染色，通過共聚焦熒光顯微鏡在隨機選擇的區域捕獲圖像。
1.3 VX765對大鼠OA的作用
1.3.1 動物模型的建立及分組
將32只SD大鼠隨機分為假手術組（A組）、OA組（B組）、OA+VX765（50 mg/kg）組（C組）和OA+VX765（100 mg/kg）組（D組）[11]，每組8只。B～D組參照Hulth法建立大鼠OA模型[12]。采用3%戊巴比妥鈉（2 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，A組僅行膝關節前內側切口，B～D組在A組基礎上橫切內側副韌帶和前交叉韌帶，并切除內側半月板；術后3 d腹腔注射青霉素（2×105 U/kg）以防細菌感染。術后1周，C、D組使用16號55 mm灌胃針分別灌胃給藥50 mg/kg和100 mg/kg VX765，A、B組給予等量生理鹽水灌胃，每日1次，共4周。
1.3.2 組織病理學檢查及Mankin 評分
末次灌胃24 h后，3%戊巴比妥鈉（2 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，取各組膝關節組織樣品于4%多聚甲醛固定3 d，10%EDTA脫鈣30 d。常規石蠟包埋，5 μm厚切片，行HE及番紅固綠染色，倒置顯微鏡下觀察。采用Mankin評分[13]評價OA軟骨退行性改變程度，范圍0（正常）～14分（嚴重OA），包括軟骨結構（0～6分）、軟骨基質染色（0～4分）、軟骨細胞（0～3分）和潮線完整性（0～1分）。
1.3.3 免疫組織化學染色分析
取上述部分切片常規脫蠟，在檸檬酸鈉緩沖液中修復抗原，與抗基質金屬蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13，MMP-13）、抗Ⅱ型膠原蛋白抗體4°C孵育過夜；PBS洗滌后，將組織與二抗37°C孵育30 min；加入適量二氨基聯苯胺顯色2 min，倒置顯微鏡觀察。
1.4 統計學方法
采用GraphPad Prism 8.0.2統計軟件進行分析。計量資料經Shapiro-Wilk正態性檢驗，均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 VX765對大鼠軟骨細胞炎癥的影響及其機制
2.1.1 CCK-8法檢測細胞活力
VX765在10 μmol/L 濃度范圍內作用24 h和48 h，軟骨細胞活力隨VX765濃度增加而上升，并在10 μmol/L時達峰值，作用48 h的細胞活力較24 h更高，但各濃度組間及同一濃度兩個時間點間差異均無統計學意義（P>0.05）。而VX765濃度高于10 μmol/L后細胞活力顯著降低，且作用48 h的細胞活力較24 h更低，差異均有統計學意義（P<0.05）。因此，可選取10 μmol/L以下濃度的VX765進行細胞實驗，我們分別用無明顯細胞毒性的4 μmol/L和8 μmol/L VX765進行后續實驗。見圖1a。
圖1
VX765對LPS誘導的軟骨細胞影響
a. CCK-8法檢測細胞活力；b. Western blot檢測各因子蛋白表達電泳圖 Mr：相對分子質量 1：對照組 2：LPS組 3：4 μmol/L VX765組 4：8 μmol/L VX765組；c. Western blot檢測各因子蛋白相對表達量；d. RT-qPCR檢測各因子mRNA相對表達量；e. ELISA檢測細胞上清液中各因子表達水平
Figure1. Impact of VX765 on LPS-induced chondrocytesa. Cell viability detected by CCK-8 assay; b. Electrophoregram of protein expressions of various factors detected by Western blot Mr: Relative molecular mass 1: Control group 2: LPS group 3: 4 μmol/L VX765 group 4: 8 μmol/L VX765 group; c. Relative protein expression levels of various factors determined by Western blot; d. Relative mRNA expression levels of various factors detected by RT-qPCR; e. Expression levels of various factors in cell culture supernatant measured by ELISA
2.1.2 軟骨細胞炎癥因子表達
Western blot、RT-qPCR及ELISA檢測示，與對照組相比，LPS組軟骨細胞炎癥因子TGF-β1、IL-6和TNF-α的蛋白、mRNA相對表達量及細胞上清液中表達水平均顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）；而加入VX765后各因子表達量較LPS組顯著降低，而且濃度越大降低趨勢越明顯，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖1b～e。
2.1.3 VX765對LPS誘導的軟骨細胞Nrf2通路的影響
Western blot檢測示，與對照組相比，LPS組Nrf2和HO-1蛋白相對表達量均顯著上升，而經VX765處理后兩者蛋白相對表達量進一步升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。通過免疫熒光染色對Nrf2進行細胞定位，結果顯示VX765的處理提高了Nrf2的表達，LPS組較對照組表達更明顯，而加入VX765后進一步促進了其表達。見圖2。
圖2
VX765對LPS誘導的軟骨細胞Nrf2通路的影響
a. Western blot檢測各因子蛋白表達電泳圖 Mr：相對分子質量 1：對照組 2：LPS組 3：4 μmol/L VX765組 4：8 μmol/L VX765組；b. Western blot檢測各因子蛋白相對表達量；c. 免疫熒光染色觀察Nrf2在細胞中的定位（共聚焦熒光顯微鏡×200） 從左至右依次為DAPI、Nrf2和二者重疊，從上至下依次為對照組、LPS組、4 μmol/L VX765組和8 μmol/L VX765組
Figure2. Influence of VX765 on the Nrf2 pathway in LPS-induced chondrocytesa. Electrophoregram of protein expressions of various factors detected by Western blot Mr: Relative molecular mass 1: Control group 2: LPS group 3: 4 μmol/L VX765 group 4: 8 μmol/L VX765 group; b. Relative protein expression levels of various factors detected by Western blot; c. Immunofluorescence staining to observe the cellular localization of Nrf2 (Confocal fluorescence microscope×200) From left to right for DAPI, Nrf2, and merge, from top to bottom for control group, LPS group, 4 μmol/L VX765 group, and 8 μmol/L VX765 group, respectively
2.2 VX765對大鼠OA的作用
2.2.1 組織病理學檢查及Mankin 評分
HE和番紅固綠染色示，A組大鼠關節結構正常，關節面平滑、關節間隙正常、軟骨細胞結構清晰，未見明顯破壞及炎癥細胞浸潤；B組大鼠關節結構嚴重破壞，關節面連續性斷裂，軟骨細胞損壞，可見大量炎癥細胞浸潤；C、D組大鼠關節結構和軟骨細胞呈輕微程度破壞，關節面不光整，關節間隙變窄。見圖3。A、B、C、D組Mankin評分分別為（0.2±0.4）、（6.8±1.0）、（5.3±0.8）、（3.0±0.9）分，B～D組Mankin評分顯著高于A組，B～D組呈逐漸下降趨勢，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
圖3
大鼠膝關節組織學觀察（倒置顯微鏡×40）
從左至右依次為A、B、C、D組 a. HE染色；b. 番紅固綠染色
Figure3. Histopathological examination of rat knee joint tissues (Inverted microscope×40)From left to right for groups A, B, C, and D, respectively a. HE staining; b. Safranin-fast green staining
2.2.2 免疫組織化學染色分析
與A組相比，B組中MMP-13表達上升、Ⅱ型膠原蛋白表達減少；而C、D組加入VX765處理后下調了MMP-13表達，同時增加了Ⅱ型膠原蛋白表達，且D組MMP-13表達較C組更低、Ⅱ型膠原表達更高。見圖4。
圖4
大鼠膝關節免疫組織化學染色觀察（倒置顯微鏡×40）
從左至右依次為A、B、C、D組 a. MMP-13；b. Ⅱ型膠原蛋白
Figure4. Immunohistochemical staining of rat knee joint tissues (Inverted microscope×40)From left to right for groups A, B, C, and D, respectively a. MMP-13; b. Collagen type Ⅱ
3 討論
OA 的特點是膝關節關節軟骨退變和喪失，以及軟骨下骨和關節邊緣新骨形成，主要癥狀是關節疼痛、變形和功能障礙。OA的發生、發展與炎癥密切相關，除滑膜細胞外，關節軟骨細胞和其他細胞均會表達炎癥介質[14]。因此，靶向炎癥途徑可能是治療OA的一個具有潛力的策略。據報道，LPS誘導的軟骨細胞炎癥模型能有效模擬OA軟骨損傷[15]。本研究中，首先使用 LPS 誘導大鼠軟骨細胞在體外模擬OA軟骨的炎癥損傷，結果顯示LPS可顯著誘導TGF-β1、IL-6和TNF-α表達與分泌，與既往報道一致[16]。此外，我們采用Hulth法制作OA模型，并以VX765治療大鼠，結果發現VX765可以減輕大鼠炎癥反應，降低關節和軟骨結構損傷，提示VX765可能減輕OA癥狀。
VX765可以抑制炎癥亞基表達，即Caspase-1以及關鍵的下游促炎癥細胞因子（如IL-1β和IL-18）[17]。VX765還可在體外抑制IL-1β、單核細胞趨化蛋白1、IL-6和IL-8的表達，從而降低疾病期間的炎癥反應[6]。與上述結果一致，本研究結果顯示VX765可顯著降低細胞TGF-β1、IL-6和TNF-α表達與分泌。TNF-α和IL-6可以誘導MMP產生，并抑制Ⅱ型膠原合成，在OA中對軟骨基質降解和骨吸收起關鍵作用[16]。MMP是參與OA關節軟骨退化的主要酶，關節軟骨由軟骨細胞和軟骨基質組成，其退化通常涉及軟骨細胞的凋亡和軟骨基質的降解。軟骨基質的主要成分是蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白，其中MMP-13降解聚集蛋白聚糖并優先消化Ⅱ型膠原蛋白，已有研究表明未變性的Ⅱ型膠原蛋白在治療OA中有效[18]。本研究結果顯示VX765可增加Ⅱ型膠原蛋白表達，并減少MMP-13表達。此外，我們在大鼠體內對VX765的抗炎作用進行了驗證，發現VX765不僅減少了炎癥細胞浸潤，還減輕了關節及軟骨細胞的損傷。在一項根尖性牙周炎研究中發現VX765可以抑制骨質流失，對骨吸收有一定作用[6]。在另一項膠原蛋白誘發的OA研究中，發現VX765可抑制疾病早期的骨髓水腫和滑膜炎，預防進行性骨侵蝕[19]。
研究表明，Nrf2/HO-1通路在細胞遭受氧化應激或炎癥刺激時升高，以應對細胞受到的應激[20]。Zhang等[21]的研究表明，IL-1β刺激的軟骨細胞中Nrf2和HO-1的表達有所上調。這項研究中，Nrf2和HO-1的表達在LPS刺激的軟骨細胞中上調。我們的研究結果表明炎癥引起的氧化壓力進一步激活了Nrf2/HO-1通路，以保護細胞免受氧化損傷。在軟骨損傷和OA的各種治療策略中，通過攝取小分子的藥理作用來增強內源性防御機制（即Nrf2信號通路）是一種潛在治療方法[4]。有研究表明，Nrf2/HO-1信號可能是激活Nod樣受體蛋白3炎癥小體的關鍵途徑，降低Nrf2表達會導致體外Nod樣受體蛋白3表達上調，這可能有助于OA的發展[22]。此外，研究表明，Nrf2增強可保護軟骨細胞免受氧化損傷和炎癥，并減緩動物模型中的OA進展[23]。同時，Nrf2基因敲除小鼠比野生型小鼠表現出更嚴重的軟骨損傷[24]，這些結果表明Nrf2信號通路參與了OA的形成和治療。本研究中，我們發現VX765對Nrf2通路具有激活作用。因此，我們推測VX765可能通過上調Nrf2表達來抑制炎癥，從而改善OA的嚴重程度和進展。
綜上述，本研究通過在LPS暴露的細胞模型（體外）和大鼠OA模型（體內）中觀察炎癥因子和軟骨變性來評估VX765的治療效果。結果提示VX765在體內、外均有效地減弱了炎癥，其潛在機制可能與Nrf2通路的激活有關，為OA的預防和治療提供了新思路。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突
倫理聲明 實驗方案經溫州醫科大學動物倫理委員會批準（wydw2023-0138）；實驗動物生產許可證批準號：SCXK（浙）2019-0001，實驗動物使用許可證批準號：SYXK（浙）2020-0014
作者貢獻聲明 黃婉然：實驗設計、細胞實驗和論文撰寫；涂君雪：動物實驗和數據收集；喬愛卿：數據分析、文獻查閱和總結；何儲君：文章審校和論文修改
骨關節炎（osteoarthritis，OA）是最常見的變性軟骨疾病，也是60歲以上人群致殘的主要原因之一[1]。由于全球壽命延長以及飲食和生活方式的改變，OA患病率也不斷增加，已成為全球第四大致殘原因，帶來巨大經濟負擔[2]。目前，OA的發病機制和病理生理學仍不清楚，炎癥被認為是促進OA發生、發展的主要病理因素[3]。脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）是革蘭陰性細胞外壁中的結構成分之一，可提供積極的免疫激活，其誘導的軟骨細胞炎癥模型可以有效反映OA中軟骨損傷程度[4]。OA的早期治療策略主要是使用非甾體抗炎藥緩解疼痛，但伴隨著大量藥物副作用[5]。目前仍缺乏用于預防或抑制OA進展的有效藥物，迫切需要療效好、副作用小的藥物來逆轉OA進展。據報道半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase-1）在OA中激活，VX765是一種小分子Caspase-1特異性抑制劑，可在體內和體外減輕炎癥[6-7]。由于具有明顯抗炎特性，VX765在多種涉及炎癥的疾病中發揮著較大治療潛力，如急性胃潰瘍、急性心肌梗死等[8-9]。因此，VX765可能在OA中具有潛在有益作用，但目前關于VX765對OA的影響及其作用機制的研究較少。鑒于此，本研究擬探討VX765對OA大鼠和軟骨細胞的影響及其可能機制，為OA的防治提供新的治療策略。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4～6周齡雄性SPF級SD大鼠35只，體質量180～200 g，購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司。大鼠于溫度25°C、濕度40%～50%環境下飼養，自由飲食、水。
FBS、DMEM培養基（GIBCO公司，美國）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8；合肥白鯊生物科技有限公司）；VX765（上海吉至生化科技有限公司）；LPS、番紅固綠（北京索萊寶科技有限公司）；BCA蛋白質檢測試劑盒、DAPI（上海碧云天生物技術股份有限公司）；GAPDH、抗Ⅱ型膠原蛋白抗體（Abcam公司，美國）；Trizol試劑（Invitrogen公司，美國）；逆轉錄試劑盒（Takara公司，日本）；ELISA試劑盒（R&D Systems公司，美國）；牛血清白蛋白、Triton X-100（Sigma Aldrich公司，美國）；二氨基聯苯胺（武漢博士德生物工程有限公司）。
酶聯免疫檢測儀（Molecular Devices公司，美國）；化學發光成像系統（Bio-Rad Laboratories，美國）；7900HT快速實時PCR系統（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；LSM-880共聚焦熒光顯微鏡（Carl Zeiss公司，德國）；倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）。
1.2 VX765對大鼠軟骨細胞炎癥的影響及其機制
1.2.1 軟骨細胞分離與培養
取3只4周齡SD大鼠腹腔注射過量3%戊巴比妥鈉處死，按照文獻 ［10］方法從膝關節軟骨分離出軟骨細胞，用含20%FBS的DMEM培養基重懸，于37°C、5%CO2條件下培養。待細胞鋪滿培養基表面約80%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代、培養，選第3代細胞進行后續實驗。
1.2.2 CCK-8法檢測細胞活力
取第3代軟骨細胞以2×105個/mL密度接種于96孔板（0.1 mL/孔），培養過夜。加入不同濃度（0、1、5、10、20、50、100 μmol/L）VX765分別處理24、48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37°C培養4 h。使用酶聯免疫檢測儀檢測450 nm處吸光度（A）值，按以下公式計算細胞活力：（A加藥?A空白）/（A未加藥?A空白）×100%。選取無明顯細胞毒性的2個VX765濃度作為后續實驗濃度。
1.2.3 Western blot檢測
根據 CCK-8 實驗結果，將細胞分為對照組、LPS組、VX765無毒性濃度1組和VX765無毒性濃度2組。除對照組外，各組細胞均加入100 ng/mL LPS處理24 h，不同濃度VX765組加入相應濃度VX765培養24 h。從軟骨細胞中提取蛋白質，并通過BCA蛋白質檢測試劑盒對總蛋白質濃度進行定量。隨后，在SDS-PAGE上分離30 μg蛋白樣品，轉移至聚偏二氟乙烯膜上，用5%脫脂牛奶封閉后，將膜分別與一抗TGF-β1、TNF-α、IL-6、核因子E2相關的轉錄因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）、血紅素氧化酶1（heme oxygenase 1，HO-1）和GAPDH在4°C下孵育過夜，接著在室溫下與二抗孵育2 h。最后，使用化學發光成像系統成像，并通過Image J軟件進行定量分析，以與GAPDH表達量的比值作為目標蛋白相對表達量。
1.2.4 實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）檢測
實驗分組和處理方法同1.2.3，培養24 h后，使用Trizol試劑提取總RNA，逆轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA，通過7900HT快速實時PCR系統進行擴增。以GAPDH為內參，應用 2–ΔΔCt 方法計算各目的基因相對表達量。引物序列見表1。
表1
RT-qPCR各基因引物序列（5′→3′）
Table1.
Primer sequence of each gene in RT-qPCR (5′→3′)
1.2.5 ELISA檢測
實驗分組和處理方法同1.2.3，培養24 h后，使用相應的ELISA試劑盒測量軟骨細胞上清液中TGF-β1、TNF-α和IL-6的水平。
1.2.6 免疫熒光染色分析
實驗分組和處理方法同1.2.3，培養24 h后，將各組軟骨細胞用4%多聚甲醛固定15 min，然后用含1%牛血清白蛋白和0.1%Triton X-100的封閉溶液處理。將細胞與抗Nrf2抗體于4°C孵育過夜，然后加入二抗在室溫下孵育1 h。細胞核用DAPI染色，通過共聚焦熒光顯微鏡在隨機選擇的區域捕獲圖像。
1.3 VX765對大鼠OA的作用
1.3.1 動物模型的建立及分組
將32只SD大鼠隨機分為假手術組（A組）、OA組（B組）、OA+VX765（50 mg/kg）組（C組）和OA+VX765（100 mg/kg）組（D組）[11]，每組8只。B～D組參照Hulth法建立大鼠OA模型[12]。采用3%戊巴比妥鈉（2 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，A組僅行膝關節前內側切口，B～D組在A組基礎上橫切內側副韌帶和前交叉韌帶，并切除內側半月板；術后3 d腹腔注射青霉素（2×105 U/kg）以防細菌感染。術后1周，C、D組使用16號55 mm灌胃針分別灌胃給藥50 mg/kg和100 mg/kg VX765，A、B組給予等量生理鹽水灌胃，每日1次，共4周。
1.3.2 組織病理學檢查及Mankin 評分
末次灌胃24 h后，3%戊巴比妥鈉（2 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，取各組膝關節組織樣品于4%多聚甲醛固定3 d，10%EDTA脫鈣30 d。常規石蠟包埋，5 μm厚切片，行HE及番紅固綠染色，倒置顯微鏡下觀察。采用Mankin評分[13]評價OA軟骨退行性改變程度，范圍0（正常）～14分（嚴重OA），包括軟骨結構（0～6分）、軟骨基質染色（0～4分）、軟骨細胞（0～3分）和潮線完整性（0～1分）。
1.3.3 免疫組織化學染色分析
取上述部分切片常規脫蠟，在檸檬酸鈉緩沖液中修復抗原，與抗基質金屬蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13，MMP-13）、抗Ⅱ型膠原蛋白抗體4°C孵育過夜；PBS洗滌后，將組織與二抗37°C孵育30 min；加入適量二氨基聯苯胺顯色2 min，倒置顯微鏡觀察。
1.4 統計學方法
采用GraphPad Prism 8.0.2統計軟件進行分析。計量資料經Shapiro-Wilk正態性檢驗，均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 VX765對大鼠軟骨細胞炎癥的影響及其機制
2.1.1 CCK-8法檢測細胞活力
VX765在10 μmol/L 濃度范圍內作用24 h和48 h，軟骨細胞活力隨VX765濃度增加而上升，并在10 μmol/L時達峰值，作用48 h的細胞活力較24 h更高，但各濃度組間及同一濃度兩個時間點間差異均無統計學意義（P>0.05）。而VX765濃度高于10 μmol/L后細胞活力顯著降低，且作用48 h的細胞活力較24 h更低，差異均有統計學意義（P<0.05）。因此，可選取10 μmol/L以下濃度的VX765進行細胞實驗，我們分別用無明顯細胞毒性的4 μmol/L和8 μmol/L VX765進行后續實驗。見圖1a。
圖1
VX765對LPS誘導的軟骨細胞影響
a. CCK-8法檢測細胞活力；b. Western blot檢測各因子蛋白表達電泳圖 Mr：相對分子質量 1：對照組 2：LPS組 3：4 μmol/L VX765組 4：8 μmol/L VX765組；c. Western blot檢測各因子蛋白相對表達量；d. RT-qPCR檢測各因子mRNA相對表達量；e. ELISA檢測細胞上清液中各因子表達水平
Figure1. Impact of VX765 on LPS-induced chondrocytesa. Cell viability detected by CCK-8 assay; b. Electrophoregram of protein expressions of various factors detected by Western blot Mr: Relative molecular mass 1: Control group 2: LPS group 3: 4 μmol/L VX765 group 4: 8 μmol/L VX765 group; c. Relative protein expression levels of various factors determined by Western blot; d. Relative mRNA expression levels of various factors detected by RT-qPCR; e. Expression levels of various factors in cell culture supernatant measured by ELISA
2.1.2 軟骨細胞炎癥因子表達
Western blot、RT-qPCR及ELISA檢測示，與對照組相比，LPS組軟骨細胞炎癥因子TGF-β1、IL-6和TNF-α的蛋白、mRNA相對表達量及細胞上清液中表達水平均顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）；而加入VX765后各因子表達量較LPS組顯著降低，而且濃度越大降低趨勢越明顯，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖1b～e。
2.1.3 VX765對LPS誘導的軟骨細胞Nrf2通路的影響
Western blot檢測示，與對照組相比，LPS組Nrf2和HO-1蛋白相對表達量均顯著上升，而經VX765處理后兩者蛋白相對表達量進一步升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。通過免疫熒光染色對Nrf2進行細胞定位，結果顯示VX765的處理提高了Nrf2的表達，LPS組較對照組表達更明顯，而加入VX765后進一步促進了其表達。見圖2。
圖2
VX765對LPS誘導的軟骨細胞Nrf2通路的影響
a. Western blot檢測各因子蛋白表達電泳圖 Mr：相對分子質量 1：對照組 2：LPS組 3：4 μmol/L VX765組 4：8 μmol/L VX765組；b. Western blot檢測各因子蛋白相對表達量；c. 免疫熒光染色觀察Nrf2在細胞中的定位（共聚焦熒光顯微鏡×200） 從左至右依次為DAPI、Nrf2和二者重疊，從上至下依次為對照組、LPS組、4 μmol/L VX765組和8 μmol/L VX765組
Figure2. Influence of VX765 on the Nrf2 pathway in LPS-induced chondrocytesa. Electrophoregram of protein expressions of various factors detected by Western blot Mr: Relative molecular mass 1: Control group 2: LPS group 3: 4 μmol/L VX765 group 4: 8 μmol/L VX765 group; b. Relative protein expression levels of various factors detected by Western blot; c. Immunofluorescence staining to observe the cellular localization of Nrf2 (Confocal fluorescence microscope×200) From left to right for DAPI, Nrf2, and merge, from top to bottom for control group, LPS group, 4 μmol/L VX765 group, and 8 μmol/L VX765 group, respectively
2.2 VX765對大鼠OA的作用
2.2.1 組織病理學檢查及Mankin 評分
HE和番紅固綠染色示，A組大鼠關節結構正常，關節面平滑、關節間隙正常、軟骨細胞結構清晰，未見明顯破壞及炎癥細胞浸潤；B組大鼠關節結構嚴重破壞，關節面連續性斷裂，軟骨細胞損壞，可見大量炎癥細胞浸潤；C、D組大鼠關節結構和軟骨細胞呈輕微程度破壞，關節面不光整，關節間隙變窄。見圖3。A、B、C、D組Mankin評分分別為（0.2±0.4）、（6.8±1.0）、（5.3±0.8）、（3.0±0.9）分，B～D組Mankin評分顯著高于A組，B～D組呈逐漸下降趨勢，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
圖3
大鼠膝關節組織學觀察（倒置顯微鏡×40）
從左至右依次為A、B、C、D組 a. HE染色；b. 番紅固綠染色
Figure3. Histopathological examination of rat knee joint tissues (Inverted microscope×40)From left to right for groups A, B, C, and D, respectively a. HE staining; b. Safranin-fast green staining
2.2.2 免疫組織化學染色分析
與A組相比，B組中MMP-13表達上升、Ⅱ型膠原蛋白表達減少；而C、D組加入VX765處理后下調了MMP-13表達，同時增加了Ⅱ型膠原蛋白表達，且D組MMP-13表達較C組更低、Ⅱ型膠原表達更高。見圖4。
圖4
大鼠膝關節免疫組織化學染色觀察（倒置顯微鏡×40）
從左至右依次為A、B、C、D組 a. MMP-13；b. Ⅱ型膠原蛋白
Figure4. Immunohistochemical staining of rat knee joint tissues (Inverted microscope×40)From left to right for groups A, B, C, and D, respectively a. MMP-13; b. Collagen type Ⅱ
3 討論
OA 的特點是膝關節關節軟骨退變和喪失，以及軟骨下骨和關節邊緣新骨形成，主要癥狀是關節疼痛、變形和功能障礙。OA的發生、發展與炎癥密切相關，除滑膜細胞外，關節軟骨細胞和其他細胞均會表達炎癥介質[14]。因此，靶向炎癥途徑可能是治療OA的一個具有潛力的策略。據報道，LPS誘導的軟骨細胞炎癥模型能有效模擬OA軟骨損傷[15]。本研究中，首先使用 LPS 誘導大鼠軟骨細胞在體外模擬OA軟骨的炎癥損傷，結果顯示LPS可顯著誘導TGF-β1、IL-6和TNF-α表達與分泌，與既往報道一致[16]。此外，我們采用Hulth法制作OA模型，并以VX765治療大鼠，結果發現VX765可以減輕大鼠炎癥反應，降低關節和軟骨結構損傷，提示VX765可能減輕OA癥狀。
VX765可以抑制炎癥亞基表達，即Caspase-1以及關鍵的下游促炎癥細胞因子（如IL-1β和IL-18）[17]。VX765還可在體外抑制IL-1β、單核細胞趨化蛋白1、IL-6和IL-8的表達，從而降低疾病期間的炎癥反應[6]。與上述結果一致，本研究結果顯示VX765可顯著降低細胞TGF-β1、IL-6和TNF-α表達與分泌。TNF-α和IL-6可以誘導MMP產生，并抑制Ⅱ型膠原合成，在OA中對軟骨基質降解和骨吸收起關鍵作用[16]。MMP是參與OA關節軟骨退化的主要酶，關節軟骨由軟骨細胞和軟骨基質組成，其退化通常涉及軟骨細胞的凋亡和軟骨基質的降解。軟骨基質的主要成分是蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白，其中MMP-13降解聚集蛋白聚糖并優先消化Ⅱ型膠原蛋白，已有研究表明未變性的Ⅱ型膠原蛋白在治療OA中有效[18]。本研究結果顯示VX765可增加Ⅱ型膠原蛋白表達，并減少MMP-13表達。此外，我們在大鼠體內對VX765的抗炎作用進行了驗證，發現VX765不僅減少了炎癥細胞浸潤，還減輕了關節及軟骨細胞的損傷。在一項根尖性牙周炎研究中發現VX765可以抑制骨質流失，對骨吸收有一定作用[6]。在另一項膠原蛋白誘發的OA研究中，發現VX765可抑制疾病早期的骨髓水腫和滑膜炎，預防進行性骨侵蝕[19]。
研究表明，Nrf2/HO-1通路在細胞遭受氧化應激或炎癥刺激時升高，以應對細胞受到的應激[20]。Zhang等[21]的研究表明，IL-1β刺激的軟骨細胞中Nrf2和HO-1的表達有所上調。這項研究中，Nrf2和HO-1的表達在LPS刺激的軟骨細胞中上調。我們的研究結果表明炎癥引起的氧化壓力進一步激活了Nrf2/HO-1通路，以保護細胞免受氧化損傷。在軟骨損傷和OA的各種治療策略中，通過攝取小分子的藥理作用來增強內源性防御機制（即Nrf2信號通路）是一種潛在治療方法[4]。有研究表明，Nrf2/HO-1信號可能是激活Nod樣受體蛋白3炎癥小體的關鍵途徑，降低Nrf2表達會導致體外Nod樣受體蛋白3表達上調，這可能有助于OA的發展[22]。此外，研究表明，Nrf2增強可保護軟骨細胞免受氧化損傷和炎癥，并減緩動物模型中的OA進展[23]。同時，Nrf2基因敲除小鼠比野生型小鼠表現出更嚴重的軟骨損傷[24]，這些結果表明Nrf2信號通路參與了OA的形成和治療。本研究中，我們發現VX765對Nrf2通路具有激活作用。因此，我們推測VX765可能通過上調Nrf2表達來抑制炎癥，從而改善OA的嚴重程度和進展。
綜上述，本研究通過在LPS暴露的細胞模型（體外）和大鼠OA模型（體內）中觀察炎癥因子和軟骨變性來評估VX765的治療效果。結果提示VX765在體內、外均有效地減弱了炎癥，其潛在機制可能與Nrf2通路的激活有關，為OA的預防和治療提供了新思路。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突
倫理聲明 實驗方案經溫州醫科大學動物倫理委員會批準（wydw2023-0138）；實驗動物生產許可證批準號：SCXK（浙）2019-0001，實驗動物使用許可證批準號：SYXK（浙）2020-0014
作者貢獻聲明 黃婉然：實驗設計、細胞實驗和論文撰寫；涂君雪：動物實驗和數據收集；喬愛卿：數據分析、文獻查閱和總結；何儲君：文章審校和論文修改
