引用本文： 楊姣, 張春芳, 徐雙蘭, 邢西遷. 循環 MicroRNAs 在急性肺栓塞中的診斷價值. 中國呼吸與危重監護雜志, 2018, 17(5): 529-531. doi: 10.7507/1671-6205.201704033 復制
急性肺栓塞（acute pulmonary embolism，APE）是臨床上高發病率和高死亡率的第三大常見心血管疾病。APE 死亡率在非治療組約為 30%，治療組約為 8%，接近 11% 的患者發生猝死，因此，APE 是臨床醫師需要面對的極大挑戰[1-3]。與此同時，肺栓塞（pulmonary embolism，PE）患者的呼吸困難、胸痛、暈厥等臨床表現缺乏特異性，導致 PE 極易漏診誤診[4-5]。目前用于診斷 PE 的包括血漿 D-二聚體測定、超聲心動圖、靜脈加壓超聲和 CT 肺動脈造影、通氣-血流灌注顯像，其中血漿 D-二聚體測定是 APE 重要的初篩檢查，但僅能排除大約 30% 的患者[1, 6]。因此，目前仍缺乏有效可靠的早期預測及診斷 APE 的生物標志物。
MicroRNAs (miRNAs) 是一類長度約為 19～25 nt 的內源性非編碼小分子 RNA，廣泛參與基因轉錄后的調控活動[7]。通過與靶基因 mRNA 的 3’非編碼區（three prime untranslated region，3’-UTR）相互作用引起靶基因 mRNA 降解或者翻譯抑制，在多種細胞進程中發揮重要調控作用[8]。目前 miRNAs 的生物學功能尚未完全得知，但已有研究證明組織中一些特定的 miRNAs 與不同的癌癥的病理發展相關[9-10]。然而，近年的研究表明，miRNAs 不僅在組織中表達，癌癥患者循環血中亦存在 miRNAs，而且在循環血中 miRNAs 也發生了特異性的改變[11-13]。有研究證明循環 miRNAs 可能是診斷急性心肌梗死有用的生物標志物[14]。此后，作為診斷惡性腫瘤和心血管疾病方面最具潛力的生物標志物，人們對循環 miRNAs 進行了一些研究，目前已成為診斷 APE 研究的熱點之一。本文就循環 miRNAs 在 APE 診斷價值中的研究進展作一綜述。
1 循環 miRNAs 在 APE 中的表達差異
崔玲等[15]采用 APE 大鼠模型，檢測 miR-134、miR-410、miR-195、miR-200c、miR-486、miR-146b、miR-34b、miR-192、miR-363、miR-328、miR-26、miR-101、let-7α 等 13 個候選 miRNAs 在 APE 發生后 1、3、6、12、24 h 的表達情況。結果表明在 APE 動物模型中的驗證結果顯示使用 SYBR Green 法 miR-134、miR-410、miR-200c、miR-34b、miR-363、miR-101 信號值難以測出，這可能是由循環血中這些 miRNAs 的表達量過低引起，也可能是因檢測方法的敏感性不夠高導致。在該實驗中 miR-486 在 APE 發生 6 h 后表達量顯著下降（P<0.05），APE 發生 12 h 時降到最低，24 h 時保持在低水平。miR-486 的受試者工作特征曲線下面積（area under receiver operating characteristic curve，AUC）為 0.740（P>0.05），對 APE 的診斷效能一般。另外，在該實驗發現循環血中 miR-195 在 APE 動物模型中 1 h 即顯著增加，6～12 h 時上升至最高，24 h 后開始下降，呈動態變化趨勢。在 APE 發生 6 h 時采樣，檢測 miR-195 其區別 APE 組和正常組的 AUC 為 0.956，當特異性為 100% 時敏感性為 80%，具有較高的診斷價值。這一結果提示 miR-195 可能是診斷 APE 的潛在生物標志物，并且在 APE 發生 6～12 h 時取樣診斷效能最佳，此時 miR-195 在循環血中含量達到最高。APE 發生 24 h 后 miR-195 的含量逐漸下降，對 APE 的診斷價值也相應減弱。由于 miR-195 在肺組織內特異表達，我們猜測 APE 時肺組織的部分細胞受損釋放 miR-195 進入循環血中，引起其含量升高的可能性較大，循環血 miR-195 是否參與調節 APE 的發生發展的病理生理過程目前尚不明確。另外，該實驗結果表明 miR-195 對 APE 診斷具有較好的特異性，D-二聚體則具有較高的敏感性，將這兩項指標聯合起來繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，發現進一步提高了診斷效能，AUC 高達 0.964，在特異性為 100% 時，敏感性可提高至 85.7%。這一結果提示在臨床應用中可以將 miR-195 與 D-二聚體結合起來為可疑 APE 的患者提供更完善的診斷依據。
2011 年 Xiao 等[16]發表的一項臨床研究結果提示 miR-134 可能是存在于血漿中的診斷 APE 的潛在標志物。該研究收集了 APE 患者，有呼吸困難、胸痛、咳嗽等癥狀的非 APE 患者，以及正常人的血漿。首先通過基因芯片技術檢測 APE 患者和正常人血漿中 miRNAs 的表達量，發現 APE 患者血漿中 miR-134 和 miR-410 的表達量較正常人增高了 10 倍以上。隨后采用 Taq Man 探針進行 qRT-PCR 反應在三組受試者中驗證，結果發現 miR-134 的表達量在 APE 患者中顯著高于正常人和非 APE 患者，而 miR-410 的表達量在 APE 患者和非 APE 患者中均顯著高于正常人，但在兩者之間表達量的差異無統計學意義。繪制 ROC 曲線顯示 miR-134 區別 APE 患者和正常人時 AUC 為 0.833，區別 APE 與非 APE 患者時 AUC 為 0.756。因此認為 miR-134 對 APE 具有一定的診斷價值。王亞平等[17]檢測西寧地區肺栓塞患者血漿 miRNA-134 的表達水平，結果發現，APE 組血漿 miRNA-134 的表達水平顯著高于慢性肺栓塞組及健康對照組，慢性肺栓塞組表達水平高于健康對照組。采用 ROC 曲線分析評判血漿 miRNA-134 在 APE 中的診斷價值，并與經典血漿診斷指標 D-二聚體做比較，結果顯示，miRNA-134、D-二聚體所對應的 AUC 分別為 0.876、0.794，對 APE 的診斷均具有統計學意義，而 miRNA-134 的 AUC 更高；分別以 1.07、5.40 μg/ml 為最佳臨界值作為判斷標準，計算 miRNA-134 和 D-二聚體診斷 APE 的敏感性和特異性，結果顯示兩者敏感性一致，但 miRNA-134 的特異性優于 D-二聚體。
2016 年 Zhou 等[18]發表的研究對 37 例 APE 患者和 37 例正常人的血漿進行 miRNA PCR 芯片檢測，共檢測出 168 種 miRNAs，在 APE 患者中有 51 種 miRNAs 的表達水平比正常人有兩倍以上的變化，12 種 miRNAs 的表達水平有五倍以上的變化。另外，Zhou 等[18]以 qRT-PCR 的方式檢測 APE 和正常人血漿中 miRNAs 的表達水平，發現 APE 患者血漿中有 14 種 miRNAs 有升高，然而 Zhou 等發現 miR-134 在 APE 和正常人中的表達水平并無顯著差異，僅有 miR-28-3p 在 APE 患者血漿中的水平較正常人有顯著差異。Zhou 等[18]隨后在 6 只比格犬 APE 模型上檢測了 miR-28-3p 的表達變化，發現 miR-28-3p 在比格犬 APE 模型血漿中的表達較模型建立前顯著升高。miR-28-3p 的臨界值為 1.66 時，miR-28-3p 區別 APE 患者和正常人時 AUC 為 0.792，敏感性和特異性分別為 0.62 和 0.83。
最新研究顯示循環 miR-1233 可作為一個敏感和特異的生物標志物用于診斷 APE，且 miR-1233 可區分 APE 和非 ST 段抬高型心肌梗死這兩個臨床癥狀類似的疾病[19]。另外，目前尚未發現 miR-1233 與冠心病和心肌梗死相關。miR-1233 區分 APE 和非 ST 段抬高型心肌梗死及正常人的 AUC 分別為 0.95 和 0.91，敏感性均為 90% 和 90%，特異性分別為 100% 和 92%，因此 miR-1233 可能為診斷 APE 的一種敏感性和特異性均較高的 miRNA。
深靜脈血栓形成是 APE 的重要相關診斷。近來研究發現，血清 miR-582、miR-195、miR-532 可鑒別深靜脈血栓形成和正常人，其 AUC 分別為 0.959、1.0 和 1.0，這些 miRNAs 被認為是診斷深靜脈血栓形成的潛在循環標志物，對于診斷 APE 是否有較高的價值尚不明確[20]。
2 循環 miRNAs 在 APE 診斷中的潛在價值及存在問題
目前的研究表明一些循環 miRNAs 的表達與 APE 的發生有關，顯示將血清 miRNAs 作為診斷 APE 的標志物前景令人鼓舞，但是仍需更多的臨床和基礎研究進一步去證實。一個 mRNA 的轉錄可能同時受多個 miRNAs 的調控，同時一個 miRNA 可能同時調控多個 mRNA 表達[21]，使得 miRNAs 的通路研究變得更為復雜。其次，血清 miRNAs 的含量仍須要標準化，曾經使用 RNU6B、let-7a、miR-16 作為組織標本的內參，但是它們在血清標本中并不適用[11]。再次，血清 miRNAs 水平的特異性和敏感性須要在大樣本中進一步驗證。與 APE 有關的特異性血清 miRNAs，它們的功能和作用需要進一步研究證實。雖然在臨床上將 miRNAs 作為敏感和穩定的生物標志物是適合的，但是，由于 APE 經常伴隨著腫瘤、自身免疫性疾病、糖尿病等，這些疾病會影響靶 miRNAs 的檢測結果。因此如何設計匹配的對照，獲得可靠的數據和結論需要細致斟酌。此外，由于人種、病因不同、樣本采取時間差異等多種原因會導致 miRNAs 的基礎水平出現不同，也為 miRNAs 的標準化帶來了困難。
循環 miRNAs 的研究采用了全血、血漿和血清樣本，全血標本因受到淋巴細胞內 miRNAs 的干擾，對結果的影響較大；血清和血漿相對更為穩定，但也存在細微差別，因在凝血過程中少量淋巴細胞裂解釋放 miRNAs，通常血清中 miRNAs 濃度略高于血漿，因此選用血清檢測循環 miRNAs 更為準確。另外，循環 miRNAs 受到手術、藥物治療等影響，選擇手術后或治療后患者會影響用于早期診斷分子標志的 miRNAs 的篩選結果。qRT-PCR 是最常用檢測方法之一，PCR 結果的校正方法和參照不同也會產生偏差。Asaga 等[22]建立了不需要分離 RNA 直接 RT-PCR 檢測 miRNAs 的技術，操作更為簡便和快捷。
綜上分析我們認為血清 miRNAs 的發現提供了廣闊的臨床應用前景，在這個新領域，需要更多的臨床和基礎研究去發現和證實。
3 展望
總之，循環 miRNAs 是極具吸引力的診斷 APE 的生物標志物，而目前臨床上缺乏特異性高、敏感性好、無創、經濟實用、適用范圍廣并且能夠早期快速診斷 APE 的指標。隨著大樣本、廣泛的臨床驗證，相信在不遠的將來，體液尤其是血清的 miRNAs，也許伴隨著其他標記，會為 APE 的臨床診斷、治療和預后判斷提供有效的無創生物標志物。
急性肺栓塞（acute pulmonary embolism，APE）是臨床上高發病率和高死亡率的第三大常見心血管疾病。APE 死亡率在非治療組約為 30%，治療組約為 8%，接近 11% 的患者發生猝死，因此，APE 是臨床醫師需要面對的極大挑戰[1-3]。與此同時，肺栓塞（pulmonary embolism，PE）患者的呼吸困難、胸痛、暈厥等臨床表現缺乏特異性，導致 PE 極易漏診誤診[4-5]。目前用于診斷 PE 的包括血漿 D-二聚體測定、超聲心動圖、靜脈加壓超聲和 CT 肺動脈造影、通氣-血流灌注顯像，其中血漿 D-二聚體測定是 APE 重要的初篩檢查，但僅能排除大約 30% 的患者[1, 6]。因此，目前仍缺乏有效可靠的早期預測及診斷 APE 的生物標志物。
MicroRNAs (miRNAs) 是一類長度約為 19～25 nt 的內源性非編碼小分子 RNA，廣泛參與基因轉錄后的調控活動[7]。通過與靶基因 mRNA 的 3’非編碼區（three prime untranslated region，3’-UTR）相互作用引起靶基因 mRNA 降解或者翻譯抑制，在多種細胞進程中發揮重要調控作用[8]。目前 miRNAs 的生物學功能尚未完全得知，但已有研究證明組織中一些特定的 miRNAs 與不同的癌癥的病理發展相關[9-10]。然而，近年的研究表明，miRNAs 不僅在組織中表達，癌癥患者循環血中亦存在 miRNAs，而且在循環血中 miRNAs 也發生了特異性的改變[11-13]。有研究證明循環 miRNAs 可能是診斷急性心肌梗死有用的生物標志物[14]。此后，作為診斷惡性腫瘤和心血管疾病方面最具潛力的生物標志物，人們對循環 miRNAs 進行了一些研究，目前已成為診斷 APE 研究的熱點之一。本文就循環 miRNAs 在 APE 診斷價值中的研究進展作一綜述。
1 循環 miRNAs 在 APE 中的表達差異
崔玲等[15]采用 APE 大鼠模型，檢測 miR-134、miR-410、miR-195、miR-200c、miR-486、miR-146b、miR-34b、miR-192、miR-363、miR-328、miR-26、miR-101、let-7α 等 13 個候選 miRNAs 在 APE 發生后 1、3、6、12、24 h 的表達情況。結果表明在 APE 動物模型中的驗證結果顯示使用 SYBR Green 法 miR-134、miR-410、miR-200c、miR-34b、miR-363、miR-101 信號值難以測出，這可能是由循環血中這些 miRNAs 的表達量過低引起，也可能是因檢測方法的敏感性不夠高導致。在該實驗中 miR-486 在 APE 發生 6 h 后表達量顯著下降（P<0.05），APE 發生 12 h 時降到最低，24 h 時保持在低水平。miR-486 的受試者工作特征曲線下面積（area under receiver operating characteristic curve，AUC）為 0.740（P>0.05），對 APE 的診斷效能一般。另外，在該實驗發現循環血中 miR-195 在 APE 動物模型中 1 h 即顯著增加，6～12 h 時上升至最高，24 h 后開始下降，呈動態變化趨勢。在 APE 發生 6 h 時采樣，檢測 miR-195 其區別 APE 組和正常組的 AUC 為 0.956，當特異性為 100% 時敏感性為 80%，具有較高的診斷價值。這一結果提示 miR-195 可能是診斷 APE 的潛在生物標志物，并且在 APE 發生 6～12 h 時取樣診斷效能最佳，此時 miR-195 在循環血中含量達到最高。APE 發生 24 h 后 miR-195 的含量逐漸下降，對 APE 的診斷價值也相應減弱。由于 miR-195 在肺組織內特異表達，我們猜測 APE 時肺組織的部分細胞受損釋放 miR-195 進入循環血中，引起其含量升高的可能性較大，循環血 miR-195 是否參與調節 APE 的發生發展的病理生理過程目前尚不明確。另外，該實驗結果表明 miR-195 對 APE 診斷具有較好的特異性，D-二聚體則具有較高的敏感性，將這兩項指標聯合起來繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，發現進一步提高了診斷效能，AUC 高達 0.964，在特異性為 100% 時，敏感性可提高至 85.7%。這一結果提示在臨床應用中可以將 miR-195 與 D-二聚體結合起來為可疑 APE 的患者提供更完善的診斷依據。
2011 年 Xiao 等[16]發表的一項臨床研究結果提示 miR-134 可能是存在于血漿中的診斷 APE 的潛在標志物。該研究收集了 APE 患者，有呼吸困難、胸痛、咳嗽等癥狀的非 APE 患者，以及正常人的血漿。首先通過基因芯片技術檢測 APE 患者和正常人血漿中 miRNAs 的表達量，發現 APE 患者血漿中 miR-134 和 miR-410 的表達量較正常人增高了 10 倍以上。隨后采用 Taq Man 探針進行 qRT-PCR 反應在三組受試者中驗證，結果發現 miR-134 的表達量在 APE 患者中顯著高于正常人和非 APE 患者，而 miR-410 的表達量在 APE 患者和非 APE 患者中均顯著高于正常人，但在兩者之間表達量的差異無統計學意義。繪制 ROC 曲線顯示 miR-134 區別 APE 患者和正常人時 AUC 為 0.833，區別 APE 與非 APE 患者時 AUC 為 0.756。因此認為 miR-134 對 APE 具有一定的診斷價值。王亞平等[17]檢測西寧地區肺栓塞患者血漿 miRNA-134 的表達水平，結果發現，APE 組血漿 miRNA-134 的表達水平顯著高于慢性肺栓塞組及健康對照組，慢性肺栓塞組表達水平高于健康對照組。采用 ROC 曲線分析評判血漿 miRNA-134 在 APE 中的診斷價值，并與經典血漿診斷指標 D-二聚體做比較，結果顯示，miRNA-134、D-二聚體所對應的 AUC 分別為 0.876、0.794，對 APE 的診斷均具有統計學意義，而 miRNA-134 的 AUC 更高；分別以 1.07、5.40 μg/ml 為最佳臨界值作為判斷標準，計算 miRNA-134 和 D-二聚體診斷 APE 的敏感性和特異性，結果顯示兩者敏感性一致，但 miRNA-134 的特異性優于 D-二聚體。
2016 年 Zhou 等[18]發表的研究對 37 例 APE 患者和 37 例正常人的血漿進行 miRNA PCR 芯片檢測，共檢測出 168 種 miRNAs，在 APE 患者中有 51 種 miRNAs 的表達水平比正常人有兩倍以上的變化，12 種 miRNAs 的表達水平有五倍以上的變化。另外，Zhou 等[18]以 qRT-PCR 的方式檢測 APE 和正常人血漿中 miRNAs 的表達水平，發現 APE 患者血漿中有 14 種 miRNAs 有升高，然而 Zhou 等發現 miR-134 在 APE 和正常人中的表達水平并無顯著差異，僅有 miR-28-3p 在 APE 患者血漿中的水平較正常人有顯著差異。Zhou 等[18]隨后在 6 只比格犬 APE 模型上檢測了 miR-28-3p 的表達變化，發現 miR-28-3p 在比格犬 APE 模型血漿中的表達較模型建立前顯著升高。miR-28-3p 的臨界值為 1.66 時，miR-28-3p 區別 APE 患者和正常人時 AUC 為 0.792，敏感性和特異性分別為 0.62 和 0.83。
最新研究顯示循環 miR-1233 可作為一個敏感和特異的生物標志物用于診斷 APE，且 miR-1233 可區分 APE 和非 ST 段抬高型心肌梗死這兩個臨床癥狀類似的疾病[19]。另外，目前尚未發現 miR-1233 與冠心病和心肌梗死相關。miR-1233 區分 APE 和非 ST 段抬高型心肌梗死及正常人的 AUC 分別為 0.95 和 0.91，敏感性均為 90% 和 90%，特異性分別為 100% 和 92%，因此 miR-1233 可能為診斷 APE 的一種敏感性和特異性均較高的 miRNA。
深靜脈血栓形成是 APE 的重要相關診斷。近來研究發現，血清 miR-582、miR-195、miR-532 可鑒別深靜脈血栓形成和正常人，其 AUC 分別為 0.959、1.0 和 1.0，這些 miRNAs 被認為是診斷深靜脈血栓形成的潛在循環標志物，對于診斷 APE 是否有較高的價值尚不明確[20]。
2 循環 miRNAs 在 APE 診斷中的潛在價值及存在問題
目前的研究表明一些循環 miRNAs 的表達與 APE 的發生有關，顯示將血清 miRNAs 作為診斷 APE 的標志物前景令人鼓舞，但是仍需更多的臨床和基礎研究進一步去證實。一個 mRNA 的轉錄可能同時受多個 miRNAs 的調控，同時一個 miRNA 可能同時調控多個 mRNA 表達[21]，使得 miRNAs 的通路研究變得更為復雜。其次，血清 miRNAs 的含量仍須要標準化，曾經使用 RNU6B、let-7a、miR-16 作為組織標本的內參，但是它們在血清標本中并不適用[11]。再次，血清 miRNAs 水平的特異性和敏感性須要在大樣本中進一步驗證。與 APE 有關的特異性血清 miRNAs，它們的功能和作用需要進一步研究證實。雖然在臨床上將 miRNAs 作為敏感和穩定的生物標志物是適合的，但是，由于 APE 經常伴隨著腫瘤、自身免疫性疾病、糖尿病等，這些疾病會影響靶 miRNAs 的檢測結果。因此如何設計匹配的對照，獲得可靠的數據和結論需要細致斟酌。此外，由于人種、病因不同、樣本采取時間差異等多種原因會導致 miRNAs 的基礎水平出現不同，也為 miRNAs 的標準化帶來了困難。
循環 miRNAs 的研究采用了全血、血漿和血清樣本，全血標本因受到淋巴細胞內 miRNAs 的干擾，對結果的影響較大；血清和血漿相對更為穩定，但也存在細微差別，因在凝血過程中少量淋巴細胞裂解釋放 miRNAs，通常血清中 miRNAs 濃度略高于血漿，因此選用血清檢測循環 miRNAs 更為準確。另外，循環 miRNAs 受到手術、藥物治療等影響，選擇手術后或治療后患者會影響用于早期診斷分子標志的 miRNAs 的篩選結果。qRT-PCR 是最常用檢測方法之一，PCR 結果的校正方法和參照不同也會產生偏差。Asaga 等[22]建立了不需要分離 RNA 直接 RT-PCR 檢測 miRNAs 的技術，操作更為簡便和快捷。
綜上分析我們認為血清 miRNAs 的發現提供了廣闊的臨床應用前景，在這個新領域，需要更多的臨床和基礎研究去發現和證實。
3 展望
總之，循環 miRNAs 是極具吸引力的診斷 APE 的生物標志物，而目前臨床上缺乏特異性高、敏感性好、無創、經濟實用、適用范圍廣并且能夠早期快速診斷 APE 的指標。隨著大樣本、廣泛的臨床驗證，相信在不遠的將來，體液尤其是血清的 miRNAs，也許伴隨著其他標記，會為 APE 的臨床診斷、治療和預后判斷提供有效的無創生物標志物。